元宝枫叶提取物的安全性毒理学研究

高丽芳 曹丽歌 田 蜜 胡子净 郜 文

(首都医科大学食品药品安全评价中心，北京100069)

元宝枫(acer truncatum Bunge)为槭树科槭树属的落叶乔木，因翅果形状像中国古代金锭“元宝”而得名。元宝枫叶提取物成分复杂［1-4］，主要成分为植物多酚及黄酮，是一种新型的脂肪酸合酶抑制剂(fatty acid synthase，FAS)，研究［5-7］已经证实其具有抗肿瘤［5，8］、减肥［9］、抗菌［1-2，10］、抗氧化［11］、抑制小胶质细胞从而抗神经炎性［12］，抑制破骨细胞激活［13］等作用。本实验对元宝枫叶提取物进行急性毒性、遗传毒性及亚慢性毒性研究，为其食用安全性提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品

元宝枫叶提取物(acer truncatum bunge leaves extract，AT)由北京首医药物研究所提供。元宝枫叶经粉碎后，用60%乙醇溶液在50℃下反复浸提2次。合并浸提液，在50℃下减压浓缩，真空干燥成粉末，得到提取物。主要功效成分为植物多酚及类黄酮。90 d喂养实验采用掺入饲料法，急性毒性试验及遗传毒性实验，受试物采用无菌蒸馏水配制，现配现用。

1.2 实验动物及环境

实验动物，SPF级ICR小鼠和Wistar断乳大鼠，实验动物合格证号:SCXK(京)2010-0009，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。首都医科大学实验动物部提供动物实验室，合格证号:SYXK(京)2010-0022，室内温度(22±2)℃，相对湿度(50±20)%。实验小鼠5只同笼饲养，喂饲块状饲料。实验大鼠，悬挂式不锈钢笼具单笼喂养。喂饲粉状基础饲料(北京科澳协力饲料有限公司提供真空包装无菌饲料，合格证号:SCXK(京)2009-0012。动物试验均经过首都医科大学伦理审查委员会认可。

1.3 菌株

鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102 4个菌株，由国家北京药物安全评价中心惠赠。4株菌株的5个遗传特性经测定都达到规定标准。

1.4 主要仪器及试剂

CA800血细胞分析仪，血细胞分析仪所用稀释液、溶血素、鞘液、清洗液等均使用仪器配套试剂。日立7180全自动生化分析仪，所用均为罗氏试剂。Leica DM1000型生物显微镜。

1.5 实验方法

采用最大耐受量法，灌胃给予元宝枫叶提取物的剂量为10 g/kg(本文剂量均按每千克体质量所摄入的克数计算)。灌胃前禁食16 h。灌胃后连续观察2周，并记录动物中毒症状及死亡情况，结果判定参照GB 15193.3-2003［14］。

1.5.2 小鼠骨髓细胞微核试验

18～22 g ICR小鼠50只，雌雄各半。以急性毒性试验中元宝枫叶提取物的最大剂量10 g/kg为最高剂量，下设1/2(5.0 g/kg)及1/4(2.5 g/kg)2个剂量组，另设阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg)及阴性对照组，每组动物雌、雄各5只。经口灌胃给药，灌胃量0.02 mL/g。连续灌胃受试物2 d(间隔24 h)于末次给药后6 h，动物颈椎脱臼处死，取胸骨骨髓，按常规制片、染色、镜检。每只动物观察1 000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，记录含微核 PCE数，计算微核率(‰)。观察嗜多染红细胞与成熟红细胞(PCE/NCE)，作为细胞毒性指标。结果判定参照GB 15193.5-2003［15］。

1.5.3 小鼠精子畸变试验

18～22 g雄性ICR种SPF级小鼠25只。以急性毒性试验中元宝枫叶提取物的最大剂量(10 g/kg)为最高剂量，下设1/2(5.0 g/kg)及1/4(2.5 g/kg)2个剂量组，另设阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg)及阴性对照组，每组动物5只。经口灌胃给药，灌胃量0.02 mL/g。连续给予受试物5 d，于第1次给予后的第35天处死动物，取双侧附睾按常规制片染色和镜检，每只动物观察1 000个精子，记录畸变精子数，计算畸变率。结果判定参照GB 15193.7-2003［16］。

1.5.4 Ames试验

采用平板预先温浴法。预试验显示AT 5.0 mg/皿时有较明显的抑菌现象，故选择以1.0 mg/皿为最大剂量，以下设 0.2 mg/皿、0.04 mg/皿、0.008 mg/皿、0.001 6 mg/皿共5个剂量。另外设立空白对照，溶剂对照(DMSO)及阳性对照组。在加入S9体外代谢系统的情况下，2-AF作为 TA97a、TA98、TA100菌株的阳性对照物，10 μg/皿;2-AA 作为 TA102 的阳性对照物，12 μg/皿。在S9体外代谢系统缺失的情况下，芴酮作为TA97a、TA98 菌株的阳性对照组，0.2 μg/皿;MMS 作为TA100、TA102菌株的阳性对照物，1 μL/皿。试验流程及结果判定参照 GB 15193.4-2003［17］。

学生的寝室都是二层铺。坏学生为了省事，便站在二层铺上往下尿尿。宿舍里一年四季总是臊气熏天。不少学生的身上都长了那种很痒的湿疹。学生的行李件件都脏兮兮的。校方在宿舍管理方面一直显得力不从心。宿舍管理员的外号叫“李叹气”。是啊，面对这种混乱的局面除了叹气还能干什么呢？

1.5.5 大鼠90 d喂养试验

选60～80 g Wistar大鼠80只，雌雄各半。以人群推荐量(0.02 g/kg)的300、100和50倍设3个剂量组，即6 g/kg、2 g/kg及1 g/kg;另设阴性对照组(粉状基础饲料)共4组，每组动物雌、雄各10只。依大鼠体质量8%折算作为饲料摄入量，按剂量配制含不同元宝枫叶提取物浓度的饲料，即4.8%、1.6%、0.8%。掺入饲料，自由摄入。实验持续90 d。实验期间每日观察动物的活动情况、毛色、摄食及排泄情况，症状及出现的时间，出现死亡时进行尸体解剖，肉眼观察脏器的病理改变，有病理改变时作病理切片作组织学观察。每周称量体质量、饲料加入量及剩余量，计算食物利用率。实验第45天时通过内眦采血进行血液学指标及生物化学指标测定，实验结束时通过内眦采血方式测定血液学指标及断头采血方式测定生化指标。实验结束时对大鼠行大体解剖观察，取肝、脾、肾、睾丸或卵巢进行称质量，计算脏器系数。同时，取高剂量组和阴性对照组20例(雌雄各半)，中低剂量组10例(雌雄各半)，心、肝、脾、胰、肾、胃、十二指肠、睾丸或卵巢进行常规制片、染片，光学显微镜下进行病理组织学检查。数据处理和结果判定参照GB 15193.13-2003［18］。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析。数据以均数±标准差(±s)形式表示。微核试验采用泊松分布统计方法进行数据处理，小鼠精子畸形试验采用Wilcoson秩和检验统计方法进行数据处理。Ames试验的结果判定以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定，受试物组回变菌落数增加1倍以上，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的差异有统计学意义的阳性反应，即认为该受试物诱变试验阳性。90 d喂养试验采用单因素方差分析，首先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，各组间均数差异无统计学意义，F值＞ F0.05，P＜0.05，则用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计，性别分开统计，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠经口急性毒性试验

试验期间未见小鼠出现中毒症状，无动物死亡。观察期结束处死动物，大体解剖观察未见异常。试验结果显示小鼠经口急性毒性试验最大耐受剂量大于10 g/kg。据此判断该受试物的急性经口毒性属实际无毒级。元宝枫叶提取物经口急性毒性实验对小鼠体质量影响，详见图1。

图1 元宝枫叶提取物经口急性毒性实验(10 g/kg)对实验小鼠体质量影响Fig.1 Effect of AT leaves extract on body weights after oral administration(10 g/kg)in male and female mice

2.2 小鼠骨髓细胞微核试验

各受试组小鼠的微核率与阴性组相比，差异均无统计学意义，表明该受试物对小鼠的骨髓细胞染色体无断裂损伤作用，详见图2。

2.3 小鼠精子畸变试验

元宝枫叶提取物高、中、低剂量组、阴性对照组和阳性对照各组小鼠的精子畸形率依次为1.14%、1.12%、1.12%、1.14%和7.86%。各剂量组小鼠精子畸形率与阴性组比较，均差异无统计学意义(P＞0.05)。阳性对照组与阴性对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。表明元宝枫叶提取物对小鼠生殖细胞无损伤作用。

图2 元宝枫叶提取物对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响(n=5)Fig.2 Effect of AT leaves extract after oral administration(10g/kg)on the incidence(‰)of micronucleated polychromatic erythrocytes(Mnpce，bar graph，left Y-axis)and the PCE/NCE(polychromatic/normochromatic erythrocyte)ratio(scatter curve，right Y-axis)in male and female mice

2.4 Ames试验

TA97a、TA98、TA100和TA102 4株2种突变类型的菌株对元宝枫叶提取物进行5个剂量的试验，在有代谢活化+S9或无代谢活化-S9系统的条件下，各剂量组的回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系，表明元宝枫叶提取物对4种突变株没有明显的诱导致突变作用，详见图3。

2.5 大鼠90 d喂养试验

2.5.1 体质量、脏器质量和食物摄入量

雄鼠喂饲高剂量元宝枫叶提取物第3周结束后，体质量与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05，图4)，而元宝枫叶提取物中、低剂量组动物实验期间各周体质量与阴性对照组相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)。整个实验期间各剂量组雌鼠体质量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，大鼠体质量增长与元宝枫叶提取物无剂量反应关系。

喂饲高剂量元宝枫叶提取物的雄性大鼠在实验第3周至第11周期间，每周食物摄入量显著低于对照组(P＜0.05)，而中低剂量组动物实验期间各周食物摄入量与阴性对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。整个实验期间各剂量组雌鼠食物摄入量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，大鼠每周食物摄入量与元宝枫叶提取物无剂量反应关系，详见图5。

3个剂量组动物食物利用率与阴性对照组相比未发现差异有统计学意义(P＞0.05，图6)。

由表1可见，3个剂量组动物的各主要脏器质量和脏器系数与阴性对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。

图3 元宝枫叶提取物对TA97a、TA98、TA100和TA102菌株回复突变影响Fig.3 Effect of AT leaves extract on bacterial reverse mutation with(+S9mix)or without(-S9mix)metabolic activation.

图4 元宝枫叶提取物对大鼠体质量影响Fig.4 Effect of AT leaves extract on mean weekly body weights at a 90-day oral toxicity study in male and female rats(±s，n=10)

图5 元宝枫叶提取物对大鼠每周食物摄入量的影响Fig.5 Effect of AT leaves extract on mean weekly food consumption per rat at a 90-day oral toxicity study in male and female rats(x ± s，n=10)

图6 元宝枫叶提取物对大鼠食物利用率影响Fig.6 Effect of AT leaves extract on mean weekly food efficiency at a 90-day oral toxicity study in male and female rats(x ± s，n=10)

表1 元宝枫叶提取物对大鼠脏器质量的影响Tab.1 Effects on organ weights in rats after 90 days of feeding (x ± s，n=10)

2.5.2 血液和生化指标

实验第45天及实验结束时，元宝枫叶提取物高、中、低剂量组动物的各项血液学指标与阴性对照组相比，差异均未无有统计学意义(P＞0.05)，详见表2。

实验中期第45天，元宝枫叶提取物高剂量组实验动物空腹血糖值低于阴性对照组(P＜0.05)，其余指标未见异常，详见表3。

2.5.3 病理组织学观察

各组大鼠器官经光镜组织学检查总体观察发现，部分标本可见中等量肝细胞体积缩小，胞质嗜酸性增强，但未见嗜酸小体形成，其中元宝枫叶提取物高剂量组雌性组变化较为明显。各组心肌组织均见灶状细胞胞质凝集、脾淤血、小肠黏膜层嗜酸性粒细胞浸润，病变未随剂量的增加而增加，考虑病变为动物本身问题。

表2 元宝枫叶提取物对大鼠血液常规的影响Tab.2 Effects of AT on hematology parameters in rats after 45 days and 90 days of feeding (x ± s，n=10)

表3 元宝枫叶提取物对大鼠血液生化的影响Tab.3 Effects of AT on clinical chemistry parameters in rats after 90 days of feeding (x ± s，n=10)

3 讨论

元宝枫是集观赏绿化、水土保持、特种用途等多种经济、社会和生态效益于一身的重要树种，日益受到人们的关注，对元宝枫开发利用也得到人们的重视。彭亮等人对元宝枫油的毒理学安全性实验研究结果提示，元宝枫油未有急性、亚慢性和遗传毒性［19］。元宝枫油作为新食品原料［国家卫生与计划生育委员会(原卫生部):关于批准元宝枫籽油和牡丹籽油作为新资源食品的公告(2011年 第9号)］［20］，已进入市场。本研究团队已另文发表给予营养性肥胖模型大鼠元宝枫叶提取物30 mg/kg 3周后，与阴性对照组比较体质量、体脂质量和脂/体比均显著降低(P ＜0.05)，且抑制脂肪酸合酶活性(P ＜0.05)［9］。但尚未发现有文献对元宝枫叶提取物安全性毒理学进行详细报道。元宝枫叶提取物作为天然来源的脂肪酸合酶抑制剂具有高效的特点，有很好的开发前景，因此对其食用安全性评价显得尤为重要。

根据体外实验及预实验的结果笔者初步推算元宝枫叶提取物减肥作用的人群推荐量为1.2 g/d，按成人60 kg体质量计为1.2 g/d，因此在90 d喂养实验中，设定人群推荐剂量的300，100和50倍，即1 g/kg，2 g/kg，6 g/kg，作为高、中、低 3 个剂量组别。本中心对元宝枫叶提取物的安全性毒理学实验研究结果显示:1)急性毒性试验:经口最大耐受量高于10 g/kg(相当于推荐剂量500倍)。以急性毒性分级，属于实际无毒物质。2)遗传试验:AMES试验、小鼠骨髓微核试验和小鼠精子畸变试验结果均为阴性。3)90 d喂养试验:结果显示在1～2 g/kg，对实验动物生长发育、食物利用率，血液系统、肝、肾功能、生殖系统以及蛋白、脂肪、糖的代谢无明显影响。在6 g/kg时对雄性实验大鼠体质量及进食量有影响(P＜0.05)，但不影响食物利用率;实验中期45 d的空腹血糖低于阴性对照组(P＜0.05)，本研究认为这是元宝枫叶提取物药理作用的放大，而不是毒性的表现。元宝枫叶提取物的降糖作用有待进一步研究。

［1］ Dong L P，Liu H Y，Ni W，et al.Four new compounds from the leaves of Acer truncatum［J］.Chem Biodivers，2006，3(7):791-798.

［2］ Dong L P，Ni W，Dong J Y，et al.A new neolignan glycoside from the leaves of Acer truncatum［J］.Molecules，2006，11(12):1009-1014.

［3］ Ma X，Tian W，Wu L，et al.Isolation of quercetin-3-OL-rhamnoside from Acer truncatum Bunge by high-speed counter-current chromatography［J］.J Chromatogr A，2005，1070(1-2):211-214.

［4］ 黄相中，潭理想，古昆，等.云南产元宝枫叶的化学成分研究［J］. 中国中药杂志，2007，32(15):1544-1546.

［5］ Zhao W H，Zhang J F，Zhe-Wang，et al.The extract of leaves of Acer truncatum Bunge:A natural inhibitor of fatty acid synthase with antitumor activity［J］.J Enzyme Inhib Med Chem，2006，21(5):589-596.

［6］ 黎金龙，王耀楠，赵文华，等.微波辅助提取元宝枫落叶中的黄酮类物质以及脂肪酸合酶抑制剂［J］.中成药，2007，29(8):1244-1248.

［7］ 樊媛洁，叶燕彬，郜文，等.元宝枫叶中有效成分的动态变化及对FAS抑制作用的研究［J］.中药材，2010，33(11):1740-1743.

［8］ 李丽华，王熙才，邱宗海，等.云南元宝枫黄酮诱导个旧肺鳞癌细胞YTMLC凋亡的实验研究［J］.肿瘤防治研究，2010，37(4):382-386.

［9］ 高丽芳，曹丽歌，田蜜，等.元宝枫叶提取物的减肥作用研究［J］. 卫生研究，2012，41(4):609-612.

［10］Kiss A K，Filipek A，Zyzynska-Granica B，et al.Effects of penta-O-galloyl-beta-D-glucose on human neutrophil function:significant down-regulation of L-selectin expression［J］.Phytother Res，2013，27(7):986-992.

［11］李志安，郭家智，刘承杏，等.枫叶黄酮对老年痴呆动物模型的抗氧化作用及分子机制［J］.神经解剖学杂志，2011，27(5):497-502.

［12］钟莲梅，宗一，戴纪男，等.元宝枫叶黄酮抑制脂多糖诱导的小胶质细胞激活的作用［J］.云南大学学报:自然科学版，2011，33(3):345-349.

［13］邹智荣，宗一，陆地，等.枫叶黄酮抑制脂多糖诱导破骨前体细胞Raw264.7细胞激活的作用［J］.昆明医学院学报，2012，33(2):4-8.

［14］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB15193.3—2003急性毒性试验食品安全性毒理学评价程序和方法［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［15］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB15193.5—2003骨髓细胞微核试验食品安全性毒理学评价程序和方法［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［16］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB15193.7—2003小鼠精子畸形试验食品安全性毒理学评价程序和方法［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［17］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB15193.4—2003鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验食品安全性毒理学评价程序和方法［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［18］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB15193.13—2003 30天和90天喂养试验食品安全性毒理学评价程序和方法［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［19］彭亮，杨峻锋，覃辉艳，等.元宝枫油的毒理学安全性实验研究［J］.中国食品卫生杂志，2011，23(1):70-75.

［20］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，关于批准元宝枫籽油和牡丹籽油作为新资源食品的公告(2011年第9号).［EB/OL］.［2011-03-29］.http://www.nhfpc.gov.cn/sps/s7891/201103/cffd9def6007444ea 271189c18063b54.shtml