清咽喉合剂微生物限度检查方法的验证

余晓霞 马永良 刘春霞

清咽喉合剂为中山大学孙逸仙纪念医院的特色中药制剂, 其主要由岗梅根、野菊花、蒲公英三种中药材煎煮浓缩制成［1］, 具有清热、消炎、解毒作用。现根据《中国药典》2010年版(一部)［2］, 对清咽喉合剂微生物限度检查方法进行验证, 以保证测定结果的可靠性。

1 仪器与材料

1.1 仪器 超净工作台(苏净集团安泰公司)、303A-1生化培养箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)、SPX-100B生化培养箱(上海悦丰仪器仪表有限公司)。

1.2 试药 营养琼脂培养基(批号：140308), 玫瑰红钠琼脂培养基(批号：140228), 营养肉汤培养基(批号：130521), 改良马丁培养基(批号：1401222), 改良马丁琼脂培养基(批号：130910), 胆盐乳糖培养基(批号：1402132), MUG培养基(批号：135012), 曙红亚甲蓝琼脂培养基(批号：1310312)(以上均来源于北京三药科技开发公司)。清咽喉合剂(规格：100 ml,批号：201312248, 201312258, 201312308, 中山大学孙逸仙纪念医院)。

1.3 菌种 大肠埃希菌(escherichia coli)［ CMCC(B)44 102］,金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］, 枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)［ CMCC(B)63 501］, 白色念珠菌(candida albicans)［ CMCC(F)98 001］, 黑 曲 霉(aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］(以上菌种的冻干菌均购自中国食品药品生物检定研究院)。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌至营养肉汤培养基, 经35 ℃培养24 h, 取其培养物, 用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍稀释至约50～100 cfu/ml的菌悬液备用。接种白色念珠菌至改良马丁培养基, 经25℃培养24～48 h, 取其培养物, 用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍稀释至约50～100 cfu/ml的菌悬液备用。取2～8℃保藏的黑曲霉孢子混悬液, 稀释至约50～100 cfu/ml的孢子悬液备用。

2.2 供试液制备 取供试品原液, 混匀, 作为供试液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.3.1 试验组 分别取供试液、试验菌液各1 ml, 注入同一平皿中, 立即倾注相应的不超过45℃的琼脂培养基, 待凝结后, 按规定培养, 点计平均菌落数。每株试验菌平行制备2个平皿。

2.3.2 菌液组 取试验菌液1 ml, 注入平皿中, 同“2.3.1”项下方法操作。

2.3.3 供试品对照组 取供试液1 ml, 注入平皿中, 也同“2.3.1”项下方法操作。

表1 计数验证各菌株回收率结果(%)

由表1可见, 用1 ml/皿供试液时, 各菌株的回收率均可达到70%以上, 且3次均能重现试验结果, 因此本品的细菌、霉菌及酵母菌计数可用平皿法检查(即1 ml/皿)。

2.4 控制菌检查方法的验证 本品为口服给药制剂, 控制菌应检查大肠埃希菌。大肠埃希菌检查法的验证：分别取供试液1 ml加至胆盐乳糖培养基100 ml中, 加入10～100 cfu大肠埃希菌, 按《中国药典》2010年版(二部)大肠埃希菌检查法进行验证。结果见表2。

表2 控制菌验证结果

由表2可见, 本品可用常规法检查大肠埃希菌。

3 讨论

研究表明［3,4］, 岗梅根和野菊花两种药材均对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等有较强的抑制作用。清咽喉合剂由以上两种药材煎煮而成。实验结果表明, 采用常规法检查清咽喉合剂的细菌、霉菌、酵母菌数, 回收率均>75%, 控制菌大肠埃希菌可检出, 该法可为清咽喉合剂微生物限度检查的标准。

［1］伍俊妍, 李国成, 林晓珊, 等.清咽喉合剂质量标准的研究.中药材, 2008, 31(9):1431-1433.

［2］国家药典委员会.中国药典(一部).北京:中国医药科技出版社, 2010：附录XIII C.

［3］何少璋, 张一萍, 喻丽元.岗梅对微生物的作用研究.现代医院,2008(5):12-13.

［4］方静, 王德, 周学琴.野菊花两种提取方式对5种常见细菌的抑菌效果的比较.数理医药学杂志, 2007, 20(3):368-369.