益气通络方对慢性缺血性肾病早期大鼠AngⅡ、α-SMA表达的影响＊

李 伟，刘兰英，李娇艳，李根茂，葛东宇

(1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029;2.北京中医药大学科研实验中心，北京 100029)

慢性缺血性肾病(chronic ischaemic renal disease，CIRD)是指因肾动脉狭窄(renal artery stenosis，RAS)或阻塞≥60%，引起肾血流动力学显著改变，从而导致肾小球滤过率下降、肾功能不全的1种慢性肾脏疾病［1］，是中老年人(年龄≥50岁)发生终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的重要原因之一［2］。临床上，我们通过益气通络法治疗慢性缺血性肾病早期病变取得了较好疗效。因此本实验拟通过观察益气通络方对慢性缺血性肾病早期大鼠肾组织AngⅡ、α-SMA表达的影响，以探讨其防治慢性缺血性肾病早期病变可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SD雄性大鼠60只，190～210 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2012-0001)。

1.2 药物

益气通络方组成:黄芪10 g，党参10 g，当归10 g，桂枝 10 g，川芎 10 g，赤芍 10 g，全蝎 6 g，地龙 6 g，熟大黄6 g，白花蛇舌草10 g，炙甘草5 g，为康仁堂制药厂生产的配方颗粒。

1.3 试剂

AngⅡ抗体:北京博奥森生物技术有限公司(货号bs-0587R);α-SMA抗体:武汉博士德生物工程有限公司(货号BM0002);兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司(货号PV-9001);小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司(货号PV-9002)。

1.4 仪器

光学显微镜:奥林巴斯公司(型号L340099);显微照相机:OLYMPUS。

1.5 方法

1.5.1 SD雄性大鼠慢性缺血性肾病模型复制方法 将模型组和各药物组的大鼠用10%的水合氯醛(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，打开腹腔，分离出双侧肾动脉，把直径为0.30 mm的针灸针与肾动脉血管长轴紧贴平行放置，用1号手术缝线将肾动脉和针灸针一起扎紧，然后抽出针灸针，关闭手术切口。假手术组除不放置针灸针和不用手术缝线紧扎外，其余手术操作均同上。

1.5.2 分组及给药 将60只SD雄性大鼠随机分为4组，每组各15只，随机分为假手术组(术后次日灌胃生理盐水3 ml/只，每日1次)、模型组(术后次日灌胃生理盐水3 ml/只，每日1次)、预防组(术前3 d灌胃益气通络方10.85 g/kg/d，每日1次)、药物组(术后次日灌胃益气通络方10.85 g/kg/d，每日1 次)。

1.5.3 取材及观察指标 术后14 d处死大鼠，迅速取其双侧肾脏，一部分放入4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片行肾脏免疫组化。免疫组化图像根据染色的深浅(光密度)及分布面积来确定目标蛋白量。采用Image-Pro P1us 6.0专业图像分析软件对图像进行分析，每张切片随机取至少5个视野，比较各组平均光密度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，符合正态分布的数据以均数±标准差(±s)表示，多组独立样本比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两比较用LSD法，各种检验的显著性水平设定为P＜0.01。

图1 各组大鼠肾组织AngⅡ免疫组化实验结果(×200)

2 结果

表1、图1、2显示，与正常组比较，模型组的AngⅡ、α-SMA表达均明显升高(P＜0.01);与模型组比较，药物组及预防组AngⅡ、α-SMA表达均明显降低(P＜0.01);预防组与药物组比较，AngⅡ、α-SMA表达明显降低(P＜0.01)。

表1 ICAM-1、AngⅡ、α-SMA 在各组表达的光密度分析(±s)

表1 ICAM-1、AngⅡ、α-SMA 在各组表达的光密度分析(±s)

注:与正常组比较:△P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.01

组 别 例数 AngⅡ α-SMA假手术组0.000 0.000 15 70.55±1.69 69.95±0.81模 型 组 15 132.61±1.57△ 105.66±0.91△药 物 组 15 109.70±1.59* 90.93±0.97*预 防 组 15 89.83±1.47* 76.21±1.07*F 283.490 286.124 P

图2 各组大鼠肾组织AngⅡ免疫组化实验结果(×200)

3 讨论

肾动脉狭窄时，肾内 RAS系统被激活，局部RAS系统被激活，有可能与慢性缺血性肾病肾间质纤维化有关。在RAS系统中，AngⅡ被认为是发挥作用的最主要因子［5］，它可以促进血管收缩，导致肾脏血流量减少，并与局部浸润活化的巨噬细胞共同参与肾脏炎症反应，导致肾脏纤维化的进展。大量研究显示，慢性缺血性肾损害可以作为肾间质纤维化的1个独立影响因素，Myo-FB又在肾缺血导致的肾间质纤维化中起重要作用，它可以分泌胶原纤维连接蛋白，促使ECM的聚集，导致肾间质纤维化。α–SMA是Myo-FB的标志性蛋白，在肾间质纤维化的早期即可出现，可作为慢性缺血性肾病肾间质纤维化的早期评判指标［6～8］。

杨步军［9］认为，本病多因先天不足，后天失养，以致脉道受损、经络阻塞、气血运行不畅、气滞血瘀而成。吴以岭络病理论［10］认为，肾动脉不全结扎致肾动脉狭窄慢性缺血性肾损伤的中医病机为肾络损伤导致肾络绌急(血管痉挛)，进而肾络郁滞、肾络瘀阻甚至肾络瘀塞，针对病变早期营卫不通、肾络郁滞病机，治疗应以益气通络为主，方以益气通络方，黄芪、党参、当归益气补血，活血通络，“血中气药”川芎行营气助血运，合桂枝有调和营卫之义，全蝎、地龙搜风通络，熟大黄、白花蛇舌草解毒通络，赤芍活血通络，合甘草缓挛急，合桂枝、甘草亦有调和营卫之义。

本课题意图揭示益气通络方防治慢性缺血性肾病的机制，结果表明益气通络方可能是通过降低AngⅡ、α-SMA的表达干预慢性缺血性肾病的发生发展。

［1］Jacobson HR.Ischemic renal disease an overlooked clinical entity? ［J］.Kidney Int，1988，34(5):729.

［2］柳昔傲.缺血性肾病诊治研究进展［J］.安徽医学，2006，27(2):166-167.

［3］贺巍，陈威，刘彦仿，等.实验性慢性肾缺血中肾小管-间质细胞表型转化的规律及意义［J］.西北国防医学杂志，2003，24(4):286-288.

［4］陈威，杨守京，刘彦仿，等.实验性慢性肾缺血模型肾小管-间质细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达和意义［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，2004，13(1):30-34.

［5］郭登洲，王月华，边东，等.活血化瘀消癥通络中药对糖尿病肾病大鼠血管紧张素系统的影响［J］.中医杂志，2010，51(1):75-78.

［6］陈威，杨守京，刘彦仿，等.实验性慢性肾缺血模型肾小管-间质细胞 α-平滑肌肌动蛋白的表达和意义［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，2004，13(1):30-34.

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［8］贺巍，陈威，刘彦仿，等.实验性慢性肾缺血中肾小管-间质细胞表型转化的规律及意义［J］.西北国防医学杂志，2003，24(4):286-288.

［9］杨步军，郝占峰，张建军，等.中西医结合治疗大动脉炎肾性高血压疗效观察［J］.中医杂志，2010，51(1):162-163.

［10］吴以岭.脉络论［M］.北京:中国科学技术出版社，2010:11，184-186.