灵长类尿酸酶假基因化机制及其与灵长类进化关系研究进展

赵百学，陈建华

尿酸酶是生物体内嘌呤代谢途径中的一种氧化酶，广泛分布于自然界多种物种体内，主要介导尿酸氧化降解的酶促反应[1-3]。自然界内的绝大多数哺乳动物具有功能型尿酸酶，而部分灵长类（大型猿类、人类）尿酸酶基因由于进化中突变事件而成为假基因不能表达功能型尿酸酶，因此后者血清内尿酸水平比前者高 3～10 倍[4-5]，这也是人类是唯一容易罹患痛风的哺乳动物的主要原因。近年来痛风在全球范围内的发病率呈上升趋势，而临床上的治疗药物比较匮乏[6]。尿酸酶类药物可以快速降解人血清中尿酸从而有效地治疗痛风，但是目前临床上使用的均是外源性尿酸酶，强烈的免疫原性限制了其使用[7]。研究灵长类尿酸酶基因失活的机制从而恢复其活性对于低免疫原性抗痛风药物的开发无疑是一条新思路。目前，灵长类尿酸酶失活的分子机制还不清楚，本文就灵长类尿酸酶的结构与功能关系、进化失活与自然选择及其失活的分子机制研究现状进行综述。

1 尿酸酶结构与功能关系的研究

不同物种尿酸酶的一级结构差异比较大，氨基酸数目和同源性都不尽相同，但是高级结构则相对保守。目前研究人员已经成功对黄曲霉菌和球形节杆菌的尿酸酶进行结晶，并且在不同分辨率层次上获得了结构模型[8-9]。哺乳动物尿酸酶由于可溶性差导致结晶困难，因此尚未得到哺乳动物尿酸酶晶体结构。从现有的微生物尿酸酶晶体结构可以看出，尿酸酶活性形式是同源四聚体（图 1），具有四个相同的活性中心，活性中心位于二聚体的界面处[10]。每个尿酸酶单体由两个对称的 T-fold 结构域串联形成，两个尿酸酶单体通过氢键结合形成桶状的二聚体结构，两个二聚体再通过氢键形成活性形式的四聚体尿酸酶。二聚体的界面处通过疏水氨基酸的相互作用形成口袋状的疏水核心，该结构是尿酸酶的活性中心负责底物的定位和 O2的结合[11-14]。

哺乳动物的尿酸酶也是保守的同源四聚体结构，与微生物尿酸酶整体结构差异不大，而相邻单体形成二聚体时的环形构象则差异很大，但是活性位点的氨基酸残基则高度保守。Kratzer 等[15]通过对哺乳动物尿酸酶的进化史进行分析构建出了高活性的哺乳动物祖先尿酸酶，结合多物种尿酸酶蛋白序列比对，推测出从祖先尿酸酶到现今的人尿酸酶进化过程中产生了 22 个对酶活性有害氨基酸错义突变位点。

Kratzer 的研究结果显示，Phe222/Ser232/Tyr240 这3 个氨基酸残基对于祖先尿酸酶活性中心的 α4-α5 元件的形成至关重要，若发生错义突变则会导致底物尿酸不能在活性位点正确定位。S232L 置换后丧失与 Gly169 形成氢键的能力，从而导致 Phe170 和 Gln236 空间取向错误和活性中心不能正确形成，最终导致底物不能在活性中心正确定位。Y240C 的置换导致活性中心附近的疏水氨基酸不能正常折叠进而影响二聚体的正确缔合。P222A 的置换导致活性中心的极性增强从而影响疏水口袋的形成和二聚体之间的相互作用。此外，其他的 19 个氨基酸的置换也都会影响尿酸酶的折叠和活性中心的形成。

图1 黄曲霉尿酸酶晶体结构模型[10]（A：黄曲霉尿酸酶同源四聚体模型；B：黄曲霉尿酸酶单体结构模型）

2 尿酸酶失活与古灵长类进化

多项研究表明灵长类尿酸酶的失活对于古灵长类的进化具有选择优势。最新的研究表明哺乳动物在果糖的存在下，尿酸可以促进机体脂肪的积累[16]。灵长类的尿酸酶失活起始于始新世，到中新世的初期彻底失活。在地质窗口期全球气候逐渐变冷，古灵长类可以获得的果实性食物逐渐减少。此时尿酸酶的失活使得其体内尿酸水平升高，促进古灵长类从植物果实中摄取的果糖在肝脏中转化成脂肪并储存下来，而脂肪的积累可以帮助古灵长类度过地球寒冷的食物匮乏期[17-18]。现代人类生活条件的改善使得人均果糖日摄取量远高于古灵长类，同时由于尿酸酶失活导致血清尿酸水平升高，因此肥胖症在全球范围内流行。这也间接表明了尿酸酶的失活对于古灵长类度过地球地质窗口期具有进化优势。

在始新世的早期，地球气候温暖，古灵长类可以获得较多的果实性食物，该类食物中含有丰富的抗坏血酸（Vc）。Vc 是一种有效的抗氧化剂可以维持灵长类体内的抗氧化水平，因此始新世早期的古灵长类没必要通过浪费自身能量合成 Vc。在这一时期 Vc 合成途径最后一步反应催化酶基因失活成为假基因导致古灵长类不再合成 Vc[19-20]，这也是基因节俭学说的有力证据。始新世后期地球气候逐渐变冷，古灵长类可获得的果实性食物减少，为了维持体内足够的抗氧化水平，在这一时期古灵长类尿酸酶失活使体内尿酸水平升高。尿酸是有效的抗氧化剂，有效地补偿了古灵长类体内Vc 合成途径的缺失。

另外，尿酸与咖啡因具有相似的化学结构，可以刺激大脑皮层的应激反应[21]，因此推测灵长类的尿酸酶失活促进古灵长类智力的进化[22]。尿酸在灵长类体内还具有提高血压的作用，古人类向现代人进化时直立行走需要较高的血压维持脑部供血，因此推测尿酸酶失活促进古灵长类直立行走能力的进化。

3 灵长类尿酸酶失活的分子机制

灵长类尿酸酶失活的分子机制还不清楚，研究人员使用RNA 杂交的方法在人肝脏细胞内检测到了尿酸酶基因的转录体，对其 cDNA 测序发现在 33 和 187 位密码子发生了无义突变，但是消除这两个无义突变依然不能恢复人尿酸酶活性[23]，可见尿酸酶失活是一个比较复杂的过程。目前关于灵长类尿酸酶失活机制的主流观点是：灵长类尿酸酶失活是渐进性活性下降的过程。研究人员曾对小鼠的尿酸酶基因进行基因敲除，该敲除型小鼠血清尿酸水平较正常小鼠急剧升高，并很快死于高尿酸型肾病，但是通过喂服尿酸生成抑制药物则可以延长该类小鼠的寿命[24]。因此这也间接表明灵长类尿酸酶失活更可能是渐进性进化事件。

学术界对于灵长类尿酸酶渐进性失活机制也有分歧。一部分研究人员认为灵长类尿酸酶失活首先发生在启动子区，启动子区序列突变导致尿酸酶的转录下调，宏观表现为古灵长类体内尿酸酶活性下降[25]。另外一部分研究人员认为灵长类尿酸酶失活首先发生在编码区，编码区内发生多个有害的氨基酸突变导致其活性的逐步降低最终沉默成为假基因。多项研究表明古灵长类尿酸酶编码区首先发生活性有害突变更可能是灵长类尿酸酶失活的机制[15,26]。Kratzer 等[15]分析了哺乳动物尿酸酶进化史，通过构建哺乳动物祖先尿酸酶及其突变体来模拟哺乳动物尿酸酶的进化轨迹。从图 2可以看出哺乳动物祖先尿酸酶基因编码区逐渐发生突变导致其活性降低，灵长类尿酸酶的失活起始于古猿类祖先的形成，即 15.7 Ma（百万年）。人尿酸酶假基因含有 3 个明显的有害突变：33 位密码子无义突变（猩猩、大猩猩、黑猩猩、人类共有）；187 位密码子无义突变（人类、黑猩猩共有）；2 号内含子序列剪切受体位点异常突变（人、黑猩猩共有）。而长臂猿尿酸酶假基因在 2 号外显子有 12 bp 的碱基缺失导致移码突变并且在 18 号密码子处发生无义突变，因此是独立的进化事件。

图2 尿酸酶基因家族的系统进化以及古老尿酸酶酶活性特点[15]（An19～An33：哺乳动物尿酸酶的进化轨迹。[ ]中的数字表示上一级物种尿酸酶进化到下一级物种尿酸酶发生突变的数目；2,411～< 10 表示尿酸酶的特异性；7.08×105*～n.d.表示尿酸酶催化效率）

Zhang 等[26]通过构建人-犬尿酸酶嵌合体、序列比对和同源模建分析了灵长类尿酸酶的进化机制，他们认为古灵长类尿酸酶首先在 119 位发生错义突变使其活性降低，然后发生了 33 位无义突变使其彻底沉默，这也印证了灵长类尿酸酶渐进性失活突变的推测。另外与微生物相比，哺乳动物尿酸酶高频率的使用 CGA 编码精氨酸，而导致发生终止突变的概率增加（CGA-TGA），这可能暗示了哺乳动物尿酸酶具有失活的趋势，同时这也与物种进化的程度相符合。

4 灵长类尿酸酶失活与现代人疾病

人尿酸酶假基因在肝脏细胞中可以转录，但是由于 33和 187 号密码子的无义突变，因此不能正常表达功能型尿酸酶，并且由于无义突变的掺入导致人尿酸酶转录体也不稳定。研究人员曾纠正这两个无义突变，但是未能恢复尿酸酶的活性。灵长类尿酸酶蛋白编码区在进化中还发生多个有害突变导致不能形成活性形式的四聚体。由于人尿酸酶的假基因化而不能表达功能型尿酸酶，因此人体内具有更高的血清尿酸水平。过高的尿酸水平会导致高尿酸血症，长期的高尿酸血症会形成痛风[27]。痛风的形成与多种因素有关，如：过食富含嘌呤的食物、酗酒、年龄、性别等[28]。随着生活水平的提高，痛风在全球范围内的发病率逐年升高。长期高尿酸血症还会形成肾结石。肿瘤患者化疗后，大量的细胞死亡释放出大量的 DNA 和 RNA 使患者体内尿酸水平急剧升高，若不加处理则会导致急性肾衰竭[29]。人体内长期高位的尿酸水平也与代谢综合征、心血管疾病的发病有关。因此，灵长类尿酸酶失活曾经对于古灵长类的进化具有选择优势，但是现今则更容易使人类罹患痛风等疾病，而开发尿酸酶药物则可以有效地补偿人尿酸酶的缺失造成的相关疾病（痛风、高尿酸血症、代谢综合征等）。

5 国内外尿酸酶药物的开发现状与趋势

目前，临床上治疗痛风和高尿酸血症的药物比较匮乏，并且长期使用后产生的严重副作用会降低患者的依从性甚至停用。尿酸酶类药物可以快速降低血清尿酸水平，甚至溶解已经形成的痛风石，具有其他化学药物难以比拟的优点。但是，临床上使用的尿酸酶类抗痛风药物均是外源性治疗蛋白，无法避免的免疫原性限制了其在痛风治疗中的应用。目前，国内外对于复活人尿酸酶或者构建人-哺乳动物嵌合尿酸酶进行了大量研究以期开发出低免疫原性的尿酸酶药物，而且结果表明这种方式具有很好的可行性。

目前已经上市的尿酸酶药物有猪-狒狒尿酸酶嵌合体（pegloticase）和重组黄曲霉尿酸酶两种[30-31]，而国内还没有进入临床的尿酸酶类药。Pegloticase 主要用于难治性痛风的治疗，长期使用会产生严重的副反应（发热、胃肠道不适等），后者主要用于肿瘤崩解综合征的治疗。当前，国外主要集中于灵长类尿酸酶复活与哺乳动物-灵长类尿酸酶嵌合体的研究，其主要目的是在保持较高的酶活性前提下尽可能地提高与人尿酸酶的同源性，可以看出与人亲缘关系更近的尿酸酶药物则更具开发和应用价值。其中，FDA 在 2010年批准的 pegloticase 比较巧妙地利用了猪尿酸酶高活性和狒狒尿酸酶与人高亲缘性的特点。Fan 等[32]研究了人与犬尿酸酶的嵌合体，该嵌合体尿酸酶在特定的位置进行氨基酸置换修饰，初步研究表明具有更好的稳定性和药理活性。还有研究人员在研究人尿酸酶复活的过程中获得一些与人尿酸酶高度同源的（> 90%）尿酸酶突变体，这些突变体具有较高的酶活性，并且可以使用 PEG 修饰的手段进一步降低免疫原性[33]。

目前，用于痛风治疗的尿酸酶药物开发一般基于对哺乳动物尿酸酶 PEG 修饰，但是 PEG 修饰后一般会造成酶活性的较大损失，并且长时间使用 PEG 修饰蛋白，修饰用的PEG 也会诱导人体内的免疫反应。因此，目前临床使用的尿酸酶药物最大的局限性便在于难以避免的免疫原性。所以，进一步研究灵长类尿酸酶失活机制，复活人尿酸酶或研发与人尿酸酶亲缘更近的高活性尿酸酶是开发低免疫原性尿酸酶药物的重要方向。

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