禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原国家参考品的研制

胡井雷，刘景利，杨 帆，徐姗姗，张从禄，刘光磊，田国彬，孙建宏*

(1.哈尔滨维科生物技术开发公司，哈尔滨150069;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨150001)

国家生物参考品系指用国际参考品标定的，或我国自行研制的(尚无国际参考品者)用于微生物(或其产物)的定性鉴定或疾病诊断的生物试剂、生物材料或特异性抗血清;或指用于定量检测某些制品的生物效价的参考物质，其效价以特定活性单位表示，不以IU表示。它的某些理化性质已经准确测定，主要用于校准仪器、评价测量方法和确定材料或产品的特性量值，在量值传递和保证测量一致性方面起着重要作用。禽流感病毒 (H5亚型)血凝抑制试验抗原国家参考品用于检测禽流感病毒(H5亚型)制品生物效价和血液凝集试验以及血凝抑制试验操作过程中的校验，目前尚无国际标准品。在检验工作中除应采用平行样、空白试验、标准曲线等减少误差的方法外，更应广泛使用标准物质来对试验的过程中进行检验，因此在检验工作中，特别是在某些特殊条件下，需要把标准物质或参考品和样品同时进行检测，通过测得标准物质或参考品的含量和实际含量间的差来检验检测数据的准确度。

禽流感病毒 (H5亚型)血凝抑制试验抗原国家参考品的研制就是为了更加准确的进行免疫监测及对疫苗免疫效果进行正确评价，对于检测血清中的抗体水平的准确性的提高具有较大的推进作用。研究依据国家一级标准物质的要求［1］和禽流感病毒(H5亚型)血凝抑制试验抗原制造及检验规程［2］(以下简称规程)以及相关国家标准中对国家参考品的要求。

1 材料与方法

1.1 材料 试验采用的病毒为规程规定的标准毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株，由国家禽流感参考实验室鉴定、保管和供应。SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 禽流感病毒(H5亚型)抗原标准品的制备

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株按照规程的规定，用生理盐水作10－5稀释，然后接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，剂量为0.1 mL/胚，接种后置于37℃孵化箱孵化，将24 h前死亡鸡胚弃去，24 h后死亡的鸡胚随时取出，至72 h，将全部鸡胚取出置于2～8℃冷却，无菌收获鸡胚尿囊液。将收获的鸡胚尿囊液经灭活、无菌检验、效价测定后，添加保护剂，保护剂参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○年版)规定的配方和配制方法制备。然后按照每瓶1 mL进行精确分装后冻干，抗原批号为201001。

1.2.2 物理性状、剩余水分及真空度测定 按规定方法［4］进行，应符合要求。

1.2.3 无菌检验 按规定的无菌检验方法［4］进行抽样检验。

1.2.4 特异性试验 按规定HI试验的方法［4］，采用制备的抗原分别对H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清进行HI试验，鉴定其对H5亚型反应的特异性。

1.2.5 抗原效价的定值 按照国家一级标准物质要求由8家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验室，采用红细胞凝集试验96孔微量板法进行标定。按照《禽流感H5亚型血凝抑制抗原国家参考品协作标定操作规范》进行操作。对被测参考样品分别做6次独立的测定，分2个单元，每个单元做3次独立测定;2个单元之间相隔不少于3 d。所获得的6个数据用描述性统计方法检验异常值，如发现有异常值，应予标明，并补做1次测定。最后报出全部结果。汇总全部原始数据，采用描述性统计方法进行分析，剔除异常值，确定适宜范围及众数。

1.2.6 均一性检验 按照国家一级标准物质要求随机抽取样品15支，用电子分析天平分别称量每支内容物的净重量，用统计学方法分析其均一性。按照国家一级标准物质要求被检组数据差异应不显著，变异系数在5%以内。

1.2.7 稳定性检验 按照国家一级标准物质要求，抗原在－20℃、4℃、37℃条件下保存，并定期进行HA价测定，每一时间均要进行2次重复测量，用统计学方法从统计上剔除可疑值，再计算每次的平均值，该值与定值的偏差应不大于标准偏差。

2 结果

2.1 禽流感病毒 HI抗原标准品物理性状检验HI抗原冻干制品均为灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后能迅速溶解。

2.2 无菌检验 HI抗原冻干制品无菌检验结果均符合规定。

2.3 剩余水分测定 四次剩余水分含量测定结果分别为 2.12%、2.07%、1.94% 和 1.32%，均小于3%，符合标准物质的要求。

2.4 真空度测定 所有安瓶真空度均呈紫色辉光，均符合要求。

2.5 特异性试验 抗原特异性检验结果显示，201001抗原只能被H5亚型阳性血清所抑制，而对H7、H9、新城疫阳性血清、鸡减蛋综合征阳性血清均呈阴性反应。

2.6 抗原效价的定值 协作标定结果见表1。经描述性统计学分析，该批抗原血凝价为1∶(160±80)，由于数据是非连续的，剔除少量异常值，适合看众数。众数是1∶80，因此将HA效价定值为1∶80，即 80 HAU/支。

表1 抗原效价协作标定结果

2.7 均一性检验 样品重量在0.1164～0.1260 g之间。描述性生物统计分析得出:样品重量平均数为0.1208 g变异系数(CV)为4.3%，被检组数据经生物统计学结果分析为差异不显著表明该批参考品装量均一。

2.8 稳定性检验 该抗原在37℃条件下保存35天HA价未下降，42 d略有降低，结果见表2。4℃保存6个月和－20℃保存24个月时HA价未下降，在统计学上亦无差异，说明该批制品稳定性良好。

表2 37℃保存的稳定性检验结果

3 讨论

H5亚型在禽流感病毒中具有重要的地位，本实验室在研制出禽流感病毒(H9亚型)血凝抑制试验抗原国家参考品后［5］，依据国家一级标准物质的要求和禽流感病毒(H5亚型)血凝抑制试验抗原制造及检验规程中的规定，结合了相关国家标准研制出禽流感病毒(H5N1亚型)血凝抑制试验抗原国家参考品。该参考品经全面检测后完全符合国家参考品的各项指标要求。

根据国家一级标准物质的要求本项实验研制的禽流感抗原国家参考品的定值只能由多家具有资质和HI检测能力的实验室进行协作标定确定，综合考虑实验室的水平、地域分布等因素，我们在国内选择了8家HI检测水平较高的实验室进行了统一的协作标定，目的就是对国家参考品进行精确定值。由于标准物质是需要一个相对较长的保存过程，所以在保存期试验中，我们也将会对在－70℃条件下保存的标准物质每年定期进行测定。

［1］ 国家标准物质中心.一级标准物质技术规范(JJClf)06－94)［S］.1994.

［2］ 中华人民共和国农业部.禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阴、阳性血清制造及检验试行规程［S］.2006.

［3］ 中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版［S］.

［4］ 中华人民共和国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版［S］.

［5］ 孙建宏，刘景利，胡井雷，等.禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原国家参考品的研制［J］.中国兽药杂志，2013，47(4):17－19.