酶联免疫法测定鸡肉中尼卡巴嗪残留

王鹤佳，刘智宏，汪 霞，黄耀凌，孙 雷

(中国兽医药品监察所，北京，100081)

尼卡巴嗪(Nicarbazine)又名球虫净，是一种广谱抗球虫药物，其为 4，4’－二硝基均二苯脲(DNC)和2－羟基－4，6－二甲基嘧啶(HDP)的等分子复合体，其中DNC含量为 67.4% ～73.0%。DNC－HDP复合体的抗球虫活性约为DNC的10倍。尼卡巴嗪对鸡、火鸡等禽类球虫病均有很好的预防和治疗效果，但蛋鸡使用尼卡巴嗪后，可导致蛋壳色素沉着，孵化率降低［1］。我国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》规定，尼卡巴嗪的标志残留物为DNC，在鸡肌肉、肝脏、肾脏、皮/脂肪中的最高残留限量均为 200 μg/kg，，同时还明确规定蛋鸡产蛋期禁用［2］。

尼卡巴嗪在畜禽产品中的测定方法主要有酶联免疫检测法［3－5］、高效液相色谱法、高效液相色谱－质谱法［6］和高效液相色谱 － 串联质谱法［7］。国内尚无商品化的酶联免疫检测试剂盒。试验通过人工抗原制备、动物免疫，获得抗DNC的抗体，并在基础上建立了鸡肉中尼卡巴嗪残留酶联免疫检测方法，其在灵敏度、准确度和精密度等方面能够满足鸡肉中尼卡巴嗪残留检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂、碳二亚胺(Carbodiimide)，N－琥珀酰－L－丙氨酰－L－丙氨酰－L－丙氨酸－4－硝基苯胺(N－succinyl－L－alanyl－L－ananyl－L－alanine－4－Nitroanilide，SAN)，均购自 sigma公司;酶标羊抗兔抗体为本实验室自制;DNC标准品，德国WITEGA公司;其他化学试剂均为分析纯。

1.1.2 溶液 洗涤缓冲液:0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，0.05%Tween －20，pH7.2。封闭液:5% 脱脂奶磷酸盐缓冲液。包被缓冲液:0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)。标准溶液:0、0.2、1、5、25、125 μg/L DNC标准品溶液。底物溶液:0.01%TMB，以0.1 mol/L磷酸盐－柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制。样品稀释液:20%甲醇水溶液。

1.1.3 仪器 酶标读数仪，型号SUNRISE，TECAN公司;台式高速冷冻离心机，型号Biofuge stratos，Heraeus公司;漩涡振荡器，型号MS2，IKA公司;电子天平，型号AE240，梅特勒公司。

1.1.4 动物 新西兰大耳白兔，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 DNC人工抗原的合成 用碳二亚胺法分别将SAN与牛血清白蛋白和兔血清白蛋白偶联作为免疫抗原及检测抗原［8］，于－20℃保存。采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定免疫抗原分子量，由公式(Ma－Mp)/Mt计算蛋白与药物结合比，其中Ma为合成抗原分子量，Mp为载体分子量，Mt为DNC分子量。

1.2.2 DNC抗体的制备和鉴定 以免疫抗原免疫白兔，首次免疫用2 mg/mL免疫抗原(以载体蛋白计)1 mL，加等量弗氏完全佐剂乳化，背部皮内多点注射。每隔2～3周加强免疫一次，用1 mg/mL免疫抗原加等量弗氏不完全佐剂，肌肉注射。最后一次免疫后10 d采血，用竞争ELISA法测定抗体效价和对100 μg/L尼卡巴嗪的抑制率。抗体效价和抑制率达到要求后，兔颈动脉放血，提取血清，于－20℃保存。

1.2.3 竞争ELISA的建立 将检测抗原用包被缓冲液稀释，包被酶联板，每孔150 μL，2～8℃放置过夜。倾去孔内液体，拍干，每孔加入封闭液250 μL，室温放置2 h，倾去孔内液体，拍干备用。每孔加入50 μL标准(或样品)溶液和50 μL抗体溶液，室温孵育1 h。倾去孔内液体，拍干，洗液洗板3次，每孔加入酶标抗体溶液100 μL，室温孵育30 min。倾去孔内液体，拍干，洗液洗板3次。加入底物溶液100 μL，避光显色20 min。每孔加入终止液100 μL，在450 nm波长处测定吸光度值。

1.2.4 标准曲线 选择从0到1000 μg/L系列浓度的标准溶液，按.1.2.3方法测定。采用R－biopharm软件，以抑制率为纵坐标，以DNC浓度为横坐标，绘制样条标准曲线，确定标准曲线工作范围。

1.2.5 50%抑制浓度(IC50) 确定合适的标准曲线工作浓度范围后，重复测定标准曲线15次，确IC50范围。

1.2.6 交叉反应率 选择尼卡巴嗪同类药物、类似物或可能联合使用药物，按1.2.3方法测定IC50，计算交叉反应率。交叉反应率=DNC IC50/待测药物IC50×100%。

1.2.7 样品前处理方法 鸡肉匀质后，称取2±0.02 g，置于50 mL 离心管内，加乙腈8.0 mL，涡旋，超声10 min，5000 r/min 离心 10 min。取上清液 4.0 mL于40～50℃下氮气吹干，加正己烷1.0 mL，加75%甲醇水溶液1.0 mL，充分涡旋混合，2000 r/min离心10 min，取下层溶液，用样品稀释液5倍稀释后供酶联免疫法测定。

1.2.8 检测限 取经确认不含待测药物的20个不同来源的鸡肉样品作为空白鸡肉样品，计算测定值的平均值和标准差，鸡肉中DNC检测限为平均值加3倍标准差。

1.2.9 准确度与精密度 取空白鸡肉样品，加入DNC标准溶液，使其添加浓度分别为50、100和200 μg/kg。每个浓度制备样品6份，测定样品浓度，重复3次。计算回收率和相对标准偏差。

2 结果

2.1 抗原和抗体的制备与鉴定 本试验合成的SAN－人血清白蛋白经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，分子量约为70 kD，SAN与蛋白结合比约为12∶1。根据报道，免疫抗原中半抗原与载体蛋白的结合比一般以5∶1～25∶1为宜，因此本抗原适宜作为免疫抗原。抗体效价为1∶2000倍。

2.2 检测方法的确定 用方阵滴定法对ELISA方法条件进行优化，检测抗原以4000倍稀释、抗DNC抗体以2000倍稀释、酶结合物以2000倍稀释、抗体与药物反应时间为1 h、酶结合物反应时间为30 min、底物反应时间为10～30 min、、抗体与药物体积比为50 μL∶50 μL、反应温度在 25℃时，最大吸光度值在1.5左右。

2.3 标准曲线 标准曲线浓度点确定为0、0.2、1.0、5.0、25.0、125 μg/L。标准曲线见图1。图中抑制率为纵坐标，DNC 浓度为横坐标，IC50为10.3μg/L。

2.4 50%抑制浓度(IC50) 统计15次IC50测定结果，其变动范围为10.0 ～19.3 μg/L(表1)。

表1 标准曲线50%抑制浓度(IC50)测定结果(μg·L－1)

2.5 检测限 鸡肉中DNC测定平均值为1.34 μg/kg，标准差为 2.62 μg/kg，检测限为 9.20 μg/kg。

2.6 特异性 测定DNC、尼卡巴嗪原料药、地克珠利、盐霉素等8种药物的IC50，计算交叉反应率，结果见表2。

表2 DNC抗体与尼卡巴嗪原料药等8种药物的交叉反应率

特异性试验结果表明，抗体对DNC和尼卡巴嗪原料药均有反应，与尼卡巴嗪原料药的交叉反应率为50%，这与原料药中约含有50%的DNC相一致。2.7 准确度与精密度 DNC以50、100和200 μg/kg三个浓度水平添加至空白鸡肉样品中，回收率范围在49.4% ～118%之间，批内、批间变异系数均小于20%。

表3 鸡肉中DNC准确度和精密度结果

3 讨论

3.1 半抗原的选择 农业部公告第235号规定尼卡巴嗪的残留标志物为DNC，但DNC分子中不具有与载体蛋白偶联的活性基团，故选择与DNC结构类似且具有活性基团的谷氨酸－γ－ρ－硝基苯胺［glutamic acid gamma－(ρ－nitroanilide)，GAN］和SAN两种化合物作为半抗原，分别对其结构进行改造后，再与大分子蛋白偶联。免疫动物后获得两种抗体，结果表明由SAN免疫获得的抗体效价远高于GAN，故选择SAN抗体进行后续试验。

3.2 溶剂的选择 DNC标准品溶解性差，不溶于甲醇、乙腈等溶剂，仅能溶解于N，N－二甲基甲酰胺(DMF)和二甲亚砜(DMSO)中，由于DMSO具有刺激性气味，故选择DMF做为溶剂。此外，通过对多种试剂的摸索，最终选择20%甲醇水溶液作为样品稀释液，既能满足样品溶解性的要求，又可将有机溶剂对酶联免疫反应的影响降至最低。

［1］ 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典兽药使用指南［M］.北京:中国农业出版社，2011:179－180.

［2］ 中华人民共和国农业部公告235号.动物性食品中兽药最高残留限量［S］.

［3］ Huet A，Mortier L，Daeseleire E，et al.Screening for the coccidiostats halofuginone and nicarbazine in egg and chicken muscle:development of an ELISA［J］.Food Additives and Contaminants，2005，22(2):128－134.

［4］ Lisa C，Terence L F，Steven R H，et al.The production and characterisation of dinitrocarbanilide antibodies raised using antigen mimics［J］.Journal of Immunological Methods，2002(264):45－51.

［5］ Hagren V，Crooks S，Elliott R H，et al.An all－on－ line dry chemistry immunoassay for the screening of coccidiostat nicarbazin in poultry eggs and liver［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(9):2429 －2433.

［6］ 章 虎，吴俐勤，杨彩梅，等.尼卡巴嗪残留量测定和安全性分析［J］.现代科学仪器，2005，1:58－60.

［7］ 孙 雷，张 骊，刘智宏，等.鸡蛋和鸡肉中尼卡巴嗪残留检测高效液相色谱－串联质谱法研究［J］.中国兽药杂志，2008，42(5):1－4.

［8］ 杨利国，胡少昶，魏平华，等.酶免疫测定技术［M］.南京:南京大学出版社，1998:395－400.