牛支原体的分离鉴定及其体外药物敏感性分析

高 铎，孔令聪，王 梓，马红霞.2*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118;2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春130118)

牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)是引起肉牛和奶牛多种疾病的重要病原体，其中以引发呼吸系统疾病最为常见［1］。自1961年从美国首次分离到牛支原体以来，全世界大多数国家都已经发生牛支原体引起疾病的相关疫情。2008年，辛九庆等首次在国内患肺炎的犊牛肺脏中分离到M.bovis，从而证实了我国部分地区发生了牛支原体肺炎疫情［1］。M.bovis的16S rRNA 序列与无乳支原体的16S rRNA 序列差异仅有 0.53%［2］，且其引起的肺炎在临床症状和病理剖检变化上与牛传染性胸膜肺炎均极为相似，这些既给牛支原体的临床诊断造成了困难，又给我国畜牧养殖业带来了恐慌。为此，本试验在对牛支原体进行分离、鉴定的基础上，进一步对其进行了耐药性检测，以期为兽医临床用药提供一定的试验基础。

1 材料与方法

1.1 病料来源 分别采自吉林省不同地区肉牛养殖场患呼吸系统疾病病牛的肺脏等组织。

1.2 主要试剂 Taq酶、dNTPs、DNA Marker 2000等均购自TakaRa公司。PPLO肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限责任公司。红霉素等6种抗生素标准品均购自中国药品生物制品检定所。DMEM培养基购自Invitrogen生命科技有限公司。细菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自生工生物工程有限公司。

1.3 病原分离鉴定 将肺脏等组织样本接种于改良的PPLO(Pleuropneumonia－Like Organisms)液体培养基中［3］，于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养3 d，将由红色变为黄色且澄清透明的培养液进行传代培养，再次出现颜色变化的培养液涂布于改良的PPLO固体培养基中，于37℃ 5%CO2培养箱中培养3～5 d，继而在40倍普通光学显微镜下观察菌落形态。牛支原体菌落具有“油煎蛋”样典型特征，经三次克隆纯化后保存菌种。

1.4 分子生物学鉴定 使用生工生物工程有限公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取牛支原体基因组，并参考Rifatbegovic M等［4］合成牛支原体oppD/F基因特异性引物对疑似菌株进行特异性PCR鉴定，使用实验室保存的牛支原体做阳性对照，同时设阴性对照，预计扩增出1912 bp的目的条带。

牛支原体和无乳支原体的16S rRNA序列差异仅有 0.53%［2］。为此，本实验参考 Yleana R［5］等设计的16S rRNA引物，对牛支原体与无乳支原体的差异碱基进行分析，继而区分牛支原体和无乳支原体。

1.5 颜色变化单位(CCU)测定 取11支无菌试管，每管加入1.8 mL PPLO肉汤培养基，于第1管加入0.2 mL菌液，充分混匀后吸取0.2 mL加入到第2管，依此类推作10倍梯度稀释至第10管，第11管不加菌液作为阴性对照，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养3～5 d，以培养液的颜色不发生变化为终点对其结果进行判定，发生颜色变化的最高稀释度为颜色变化单位。支原体学推荐使用的支原体菌液最佳浓度为 103～104CCU/0.2mL［6］。

1.6 MIC的测定 根据CLSI的指导方针［7］，参考支原体学［6］，将各抗生素溶解并稀释成2048 μg/mL的抗生素贮存液，采用改良的微量稀释法药物敏感性实验测定M.bovis对药物的体外敏感性。

2 结果

2.1 临床分离的牛支原体菌落形态 牛支原体在低倍显微镜下呈典型的“油煎蛋”样，圆形，边缘整齐，周边为一层薄薄的透明颗粒区，为菌落在琼脂表面散开的生长部分;中央部分较厚，颗粒状，为陷入琼脂内部的生长部分。如图1所示。

图1 M.bovis的菌落形态(40×)

2.2 临床分离的牛支原体分子生物学鉴定 利用牛支原体oppD/F基因特异性引物扩增出1912 bp的片段，与预期片段大小相符。结果如图2所示。

图2 M.bovis的oppD/F基因的扩增结果

通过Yleana R［5］等设计的16S rRNA引物扩增出360 bp的片段，与预期片段大小相符，测序后对其碱基序列进行BLAST分析显示，所分离菌株的16S rRNA相应序列与模式株PG45的相应序列同源性为100%，与无乳支原体PG2的相应序列同源性为98%。证明所分离的4株疑似菌株均为牛支原体，而非无乳支原体。结果如图3所示。

图3 M.bovis的16S rRNA基因的扩增结果

2.3 MIC测定结果 改良的微量稀释法测定4株牛支原体的MIC值显示，所有菌株均对泰乐菌素耐药(MIC≥64 μg/mL)，对红霉素和阿奇霉素高度耐药(MIC≥256 μg/mL);所有菌株均对强力霉素相对敏感(MIC≤2 μg/mL)，对环丙沙星、恩诺沙星相对敏感(MIC≤0.5 μg/mL)(表1)。

表1 6种抗生素对四株牛支原体的药敏实验结果(μg·mL-1)

3 讨论

本试验从吉林省不同地区肉牛养殖场患呼吸系统疾病病牛的肺脏等组织分离病原菌。采用形态学观察，并经分子生物学手段对临床分离菌进行鉴定，最终确定所分离的四株菌株均为牛支原体，并非无乳支原体或丝状支原体。牛支原体是呈世界性分布的重要传染病病原，其引发的疾病已给国外养牛业造成了严重的经济损失［8－9］，近年来我国多个省市也陆续出现牛支原体肺炎的相关报道［1，3，10］，其病原分离情况与本研究相似，均分离自经长途运输后患呼吸系统疾病的育肥架子牛中。

本实验采用改良的微量稀释法测定了四株M.bovis的MIC值。改良的微量稀释法与传统微量稀释法相比，具有灭菌处理简便、可重复性好等特点。受试药物的敏感折点值判断标准主要参考Ricardo F Rosenbusch［11］等的建议。其结果表明，四株 M.bovis均对大环内酯类抗生素耐药，建议临床上暂时停止使用大环内酯类抗生素治疗M.bovis引起的疾病。此外，四株M.bovis均对环丙沙星等氟喹诺酮类抗生素、强力霉素等较为敏感。此结果与国外报道的M.bovis的耐药情况较为一致，均表现对大环内酯类药物耐药，且对氟喹诺酮类及四环素类抗生素较为敏感。David Francoz等使用E test测定了58株牛支原体的MIC值，所有菌株均对红霉素高度耐药(MIC≥256 μg/mL)，部分菌株对阿奇霉素高度耐药(MIC≥256 μg/mL)，多数菌株对恩诺沙星较为敏感(MIC≤0.5 μg/mL)［12］。Irena Gerchman 等分别使用微量稀释法与E test对进口与本地牛中分离的牛支原体的MIC值进行测定，结果也显示这些菌株对大环内酯类抗生素高度耐药，对氟喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素敏感［13］。在实验室鉴定的基础上对其进行合理的用药是治疗牛支原体引起疾病的有效措施。

［1］ 辛九庆，李 媛，郭 丹，等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体［J］.中国预防兽医学报，2008，30(9):661－664.

［2］ 辛九庆，李 媛，董 惠，等.牛支原体套式PCR检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2009，31(9):709－711.

［3］ 石 磊，龚 瑞，尹争艳，等.肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断［J］.华中农业大学学报，2008，27(5):629－633.

［4］ M Rifatbegovic，P Assuncao，J B Poveda，et al.Isolation of Mycoplasma bovis from the respiratory tract of cattle in Bosnia and Herzegovina［J］.Veterinary Record，2007，160:484 －485.

［5］ Yleana R，Chavez Gonzalez，Carlos Ros Bascunana，et al.In vitro amplification of the 16s rRNA genes from Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae by PCR［J］.Veterinary Microbiology，1995，47:183－190.

［6］ 吴移谋，叶元康.支原体学［M］.北京:人民卫生出版社，2008:16－25.

［7］ CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals;Approved Standard－Fourth Edition.CLSI document VET01－A4.Wayne，PA:Clinical and Laboratory Standards Institute;2013.

［8］ Marie － Anne Arcangioli，Arnaud Duet，Gilles Meyer，et al.The role of Mycoplasma bovis in bovine respiratory disease outbreaks in veal calf feedlots［J］.The Veterinary Journal，2008，177:89 －93.

［9］ A Gabinaitiene，J Siugzdaite，H Zilinskas，et al.Mycoplasma bovis and bacterial pathogens in the bovine respiratory tract［J］.Veterinarni Medicina，2011，56(1):28 – 34.

［10］冉智光，谢建华，骆 璐，等.我国部分地区牛支原体肺炎和关节炎的病原体诊断［J］.中国预防兽医学报，2010，32(1):40－43.

［11］ Ricardo F Rosenbusch，Joann M Kinyon，Michael Apley，et al.In vitro antimicrobial inhibition profiles of Mycoplasma bovis isolates recovered from various regions of the United States from 2002 to 2003 ［J］.Vet Diagn Invest，2005，17:436 – 441.

［12］ David Francoz，Mado Fortin，Gilles Fecteau，et al.Determination of Mycoplasma bovis susceptibilities against six antimicrobial agents using the E test method［J］.Veterinary Microbiology，2005，105:57 －64.

［13］ Irena Gerchman，Sharon Levisohn，Inna Mikula，et al.In vitro antimicrobial susceptibility of Mycoplasma bovis isolated in Israel from local and imported cattle［J］.Veterinary Microbiology，2009，137:268－275.