三种喹诺酮类药物在鸡蛋中残留消除规律的研究

章 敏，宁 军，余军军，韦 田，邰 镝

(广东温氏食品集团股份有限公司，广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东新兴527439)

诺氟沙星(norfloxacin，NOR)、氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)均属于喹诺酮类药物(quinolones，QNs)，该类药物是一类新型、高效、广谱、低毒的人工合成抗菌药，在畜牧养殖中广泛用于预防与治疗动物疾病，对革兰氏阳性菌特别是绿脓杆菌，以及革兰氏阴性菌有效，对支原体、衣原体也有良好抗菌作用。随着QNs在食品动物中大量使用，残留于食品中的药物会直接危害消费者健康，有报道［1］称喹诺酮类药物对人体会造成全身性损害、神经和精神系统损害，对消化系统、泌尿系统、呼吸系统的不良反应也相对较多。为了避免消费者受到喹诺酮类药物残留的危害，各国都有制定其在组织中最高残留限量，而美国则禁止喹诺酮类药物应用于动物源性食品。我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》［2］规定了喹诺酮类药物禁止使用于蛋鸡产蛋期。本试验在广东温氏食品集团某种鸡场开展，实地对两种优质在产种鸡(天露草鸡和竹丝鸡)进行拌水给药试验，旨在通过建立的检测方法的最低检测限计算停药期，以确定临床蛋鸡在产蛋前使用诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星后，不会有药物残留于鸡蛋中，降低消费者因食用含有喹诺酮类药物残留的鸡蛋而对身体造成的伤害，本试验结果可指导喹诺酮类药物在临床合理用药以及为休药期的制定提供参考，具有很强的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 对照品:诺氟沙星，纯度99.5%;氧氟沙星，纯度 99.0%;恩诺沙星，纯度 99.0%，均由中国兽医药品监察所提供;诺氟欣(5%烟酸诺氟沙星)、氧氟沙星可溶性粉(含量2%)、恩诺沙星可溶性粉(含量5%)，均由广东大华农动物保健品股份有限公司生产;甲醇、乙腈为色谱纯，正己烷、磷酸、三乙胺、无水硫酸钠等均为分析纯。

1.1.2 实验动物 三座天龄分别为166、272、299 d的天露草鸡，两座天龄分别为270、288 d的竹丝鸡，由广东温氏食品集团某种鸡场提供。

1.1.3 仪器与设备 Agilent－1100系列高效液相色谱仪及化学工作站，包括自动进样器、荧光检测器、恒温柱温箱、真空在线脱气装置;Milli Q去离子水发生器:美国Millipore公司;均质器:天津四方公司;离心机、振荡器:金坛杰瑞尔公司;氮吹仪、隔膜真空泵:津腾公司;分析天平感量:0.01 g;不同量程的移液枪;50、15 mL离心管。

1.2 方法

1.2.1 动物实验与采样 已经开产的健康的三座天露草鸡和两座竹丝鸡，自由采食和饮水，饲喂不含药物的全价日粮饲料，于用药前一天每座随机收集7枚空白鸡蛋样品。动物给药:3座天露草鸡分别通过饮水投给诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星药物，30包(200 g/包)5%烟酸诺氟沙星可溶性粉、50包(100 g/包)2%氧氟沙星可溶性粉、50包(100 g/包)5%恩诺沙星可溶性粉，分别溶于1200 kg水中，连续给药3 d;两座竹丝鸡分别通过饮水投给诺氟沙星、氧氟沙星药物，给药剂量与方法同天露草鸡。采样方法:在停药后 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 d 时间点分别于每座随机收集7枚鸡蛋样品，并随机选取5枚打碎于匀浆杯中，均质后分装于密封袋中，4℃冰箱保存。

1.2.2 试液的配制 标准储备液:精密称取诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星各10.01 mg于100 mL棕色容量瓶中，分别用甲醇溶解并定容至刻度。复溶液:甲醇－乙腈－水(1+1+2，V/V/V)。

1.2.3 鸡蛋样品的前处理方法 准确称取5.00 g已匀浆好的鸡蛋样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋30 sec，加入5 g左右的无水硫酸钠，涡旋 30 sec，振荡 20 min，4000 r/min离心5 min，吸取5 mL乙腈层于15 mL离心管中，40℃空气吹干浓缩。加入1 mL复溶液复溶，加入2 mL乙腈饱和正己烷除脂，涡旋30 sec，3000 r/min离心5 min;去掉正己烷层，重复此除脂操作一次，下清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。

1.2.4 色谱分析条件 色谱柱:Venusil ASB C18分析柱(5 μm，250 mm × 4.6 mm);流动相:0.05 mol/L磷酸溶液/三乙胺(pH 2.4)－乙腈(80+20，V/V);流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量 20 μL;荧光检测器检测:激发波长280 nm，发射波长450 nm。

1.2.5 标准曲线的制备 诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星三种标准溶液分别用流动相稀释成浓度依次为 10、20、50、100、200、500、1000 μg/L 的系列标准浓度，制作标准曲线。

1.2.6 检测限和定量限 称取已均质好的空白鸡蛋样品，添加一定量诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星标液，使得样品中的药物浓度为5、10、15 μg/kg，每个浓度做5个重复，分别按上述方法进行处理和HPLC检测，以最低检出浓度计算，信噪比(S/N)≥3对应的浓度为检测限，信噪比(S/N)≥10对应的浓度为定量限。

1.2.7 准确度与精密度 采用在空白鸡蛋样品加标的方法进行准确度和精密度的测定。在空白鸡蛋中添加低、中、高三个浓度的诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星样品(15、50、100 μg/kg)，每个浓度样品做 5个平行，3个批次，同日测定，不同批次间隔一天或者数天，分别计算回收率、批内和批间变异系数。

1.2.8 采集鸡蛋样品的测定 检测方法同1.2.3项。

2 结果与讨论

2.1 色谱图 在本实验所选条件下，NOR保留时间为5.5 min左右、OFL保留时间6.0 min左右、ENR保留时间为7.4 min左右，如图1～图3所示。空白样品在保留时间均无色谱峰出现，样品杂质峰与药物峰分离效果好。

图1 三种药物标液色谱图

图2 空白鸡蛋样品色谱图

图3 鸡服用喹诺酮类药物后鸡蛋样品色谱图

2.2 标准曲线、线性范围与检测限 在选定的色谱条件下，各浓度混合标准工作液分别用HPLC测定，以药物浓度(C)与相应色谱面积(A)作线性回归，在药物浓度为10～1000 μg/L范围内线性良好，相关系数均在0.999以上，满足残留检测的要求。具体结果见表1。空白鸡蛋样品标准添加的检测限为 5 μg/kg，定量限为 15 μg/kg，均满足残留检测的要求。

表1 喹诺酮类药物的线性回归及相关系数

2.3 回收率和变异系数 按照1.2.4项所述方法处理添加15、50、100 μg/kg三个浓度的混合标液，回收率均在75%以上，批内变异系数、批间变异系数均小于10%。具体数据见表2。

表2 喹诺酮类药物的回收率及变异系数

2.4 药物的提取 鸡蛋中含有大量的水分、蛋白质和卵磷脂，因此样品的提取和净化的主要目的是沉淀蛋白质、去脂肪和提取目标物。沉淀蛋白常用的方法有使用乙醇、甲醇和乙腈等有机溶剂，或者用乙酸、甲酸、磷酸和三氯乙酸等酸性溶液［3］。在方法研究过程中，对样品的提取液进行了实验摸索，所选的试剂最好既要沉淀蛋白又能提取目标物质，参考相关［4－7］文献报道，根据实验室条件，发现鸡蛋样品在乙腈提取和沉淀蛋白后，再经过正己烷除脂过程，样品的上清液很清亮且回收率及色谱分离效果均可达到要求。该方法提取过程简单、便捷、成本低，适用于鸡蛋样品中喹诺酮类药物的残留检测。

2.5 鸡蛋中药物的残留与消除 从表3可以分析出，天露草鸡和竹丝鸡分别连续拌水诺氟沙星和氧氟沙星3 d后，在停药的第8天收集的鸡蛋中药物已基本检测不出;天露草鸡在连续拌水恩诺沙星3 d后，鸡蛋内富集的浓度逐渐增大，从停药后的第3天开始降低，第8天已基本检测不到恩诺沙星，但痕量水平的恩诺沙星代谢较慢，在第12天已基本测不出。

3 结论

本研究建立了一种诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星在鸡蛋中残留的高效液相色谱荧光检测法，在10～1000 μg/L添加浓度范围内平均添加回收率在75%以上，批内、批间变异系数均小于10%，检测限为5 μg/kg，该方法整个提取过程便捷、快速、成本低，适用于大量鸡蛋样品中喹诺酮类药物的残留检测。

表3 两品种种鸡鸡蛋中喹诺酮类药物的残留量 μg·kg－1

从试验的结果可以看出，通过检测鸡蛋中药物的残留量监控诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星在蛋鸡产蛋前使用后体内的代谢情况，从而确保鸡蛋中无此类药物残留，保障消费者的食品安全。在产的3座天露草鸡分别连续饮服溶于1200 kg水的30包(200 g/包)5%烟酸诺氟沙星可溶性粉、50包(100 g/包)2%氧氟沙星可溶性粉、50包(100 g/包)5%恩诺沙星可溶性粉3 d，两座竹丝鸡分别通过饮服同剂量的诺氟沙星、氧氟沙星后，建议天露草鸡和竹丝鸡在产蛋前10 d左右停用诺氟沙星和氧氟沙星，天露草鸡在产蛋前14 d左右停用恩诺沙星。

［1］ 魏 东，李振华，张乃生.喹诺酮类药物的不良反应［J］.动物医学进展，2006，27(7):105 －107.

［2］ 中华人民共和国农业部公告(第235号).动物性食品中兽药最高残留限量［S］.

［3］ 廖 兰，饶 勇，杨桂香，等.检测鸡蛋中12种喹诺酮类药物残留的HPLC方法［J］.中国农业科学，2008，41(8):2419－2424.

［4］ 李 丹，张玉洁，仲 锋，等.鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量检测方法研究［J］.中国兽药杂志，2010，44(6):1 －4.

［5］ 刘波静.4种氟喹诺酮类药物在肉鸡组织中残留的研究［J］.中国畜牧兽医，2007，34(1):112 －115.

［6］ 刘俊华，鹿翠珍，石丽敏，等.肉鸡组织中四种氟喹诺酮类药物休药期的探讨［J］.中国兽药杂志，2010，44(5):14 －17.

［7］ 潘 媛，牛 华，程晓云，等.动物源性食品中六种氟喹诺酮类残留检测前处理的优化［J］.中国兽药杂志，2011，45(4):28－32.