食管鳞癌中14-3-3σ表达的临床意义及与预后的相关性

魏 华，王 明，刘瑞敏，张 天，马 瑾，马远方*，齐义军*

(河南大学 1.医学院 细胞与分子免疫学重点实验室；2.淮河医院 内窥镜室，河南 开封 475004)

研究论文

食管鳞癌中14-3-3σ表达的临床意义及与预后的相关性

魏 华1,2，王 明1，刘瑞敏1，张 天1，马 瑾1，马远方1*，齐义军1*

(河南大学 1.医学院 细胞与分子免疫学重点实验室；2.淮河医院 内窥镜室，河南 开封 475004)

目的确定14-3-3σ与食管鳞状细胞癌(ESCC)临床病理特征及与预后的相关性。方法-86 ℃冻存的TNM Ⅰ～Ⅳ期ESCC 80例，ESCC组织芯片含ESCC 86例；分别应用Western blot、免疫组织化学检测80例冻存、组织芯片中86例ESCC中14-3-3σ的表达；Kaplan-Meier分析14-3-3σ、临床病理资料与ESCC术后整体生存期相关性。结果14-3-3σ蛋白主要表达于胞质及胞膜，其阳性表达与淋巴结转移、TNM分期呈负相关，与分化程度正相关(P< 0.05)；14-3-3σ高表达及低表达ESCC患者术后平均生存时间分别为39.82和28.45个月，5年整体生存率分别为43.31%和24.8%(log-rank test,P<0.01)，TNM分期和14-3-3σ是影响ESCC预后的独立因素。结论14-3-3σ低/失表达可能是ESCC预后不良的分子标志物之一。

食管鳞状细胞癌；14-3-3σ；生物标志物；预后

食管癌(esophageal cancer, EC)是世界上八大常见的恶性肿瘤之一[1]。在中国，EC的主要组织学类型为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)，约占所有EC的90%[2]。近20年来，尽管EC的临床治疗手段不断改善，但术后EC的预后仍然很差，5年整体生存率为15%～34%[3]，而早期EC患者术后的5年整体生存率可达到90%[4]。因此，早期发现、早期诊断和早期治疗是提高食管癌治愈率的关键因素之一。

14-3-3蛋白家族中，14-3-3σ与肿瘤发生发展的关系最为密切，是候选抑癌基因之一，其异常表达见于人类多种肿瘤[5]。本研究采用Western blot和免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)检测14-3-3σ在不同临床分期ESCC中的表达规律，探讨14-3-3σ与ESCC患者临床病理特征及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

80例(每期20例)TNMⅠ-Ⅳ期ESCC及配对手术切缘组织来源于林州市肿瘤医院，组织离体后立即置于液氮或-86 ℃冰箱保存(获知情同意书)。ESCC组织芯片(上海芯超生物科技有限公司, HEso-Squ172Sur-01)包含86例，临床病理资料见表1。鼠抗人14-3-3σ抗体(SC-100638)和生物素标记山羊抗鼠二抗(P0447)(Santa Cruz公司)(Dako公司)。

1.2 Western blot

应用组织裂解液(8 mol/L尿素, 4 %3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸水合物, 40 mmol/L的DTT)提取组织蛋白，BSA法测蛋白浓度，40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印蛋白至PVDF膜，5 %脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗孵育过夜(1∶5 000)，二抗室温孵育1 h (1∶10 000)，加ECL后暗室显影，ImageScanner扫描Western blot图像，Quantity One软件进行半定量分析。

1.3 IHC及评分

IHC采用ABC法。IHC染色强度分为阴性(0)、弱阳性(1)、中度阳性(2)和强阳性(3)；阳性细胞数分为<10%(0)、10%～25%(1)、25%～50%(2)、50%～75%(3)和>75%(4)。IHC染色强度和阳性细胞之积为IHC综合评分(1～12)。

1.4 统计学分析

SPSS17.0分析软件进行统计学处理，各组间的分析采用t检验，ESCC患者生存分析采用Kaplan-Meier曲线和log-rank test检验，平均随访时间为42.3±6.5个月，中位生存时间是27.9±4.7个月。

2 结果

2.1 不同临床分期ESCC中14-3-3σ的表达

14-3-3σ在ESCC中的表达显著低于切缘正常食管黏膜组织，随着临床分期的进展，ESCC组织中14-3-3σ表达降低更加显著，而切缘组织中14-3-3σ的表达与此相反 (P< 0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with TNM-Ⅰ图1 Western blot显示TNM Ⅰ～Ⅳ期ESCC中14-3-3σ表达;Fig 1 Western blot shows 14-3-3σ protein expression in ESCC of TNM Ⅰ～Ⅳ stage

A.well-differention; B.moderate-differention; C.poor-differention图2 免疫组化显示ESCC中14-3-3σ表达；Fig 2 Immunohistochemistry shows 14-3-3σ protein expression in ESCC(×200)

2.2 14-3-3σ表达与临床病特征的相关性

14-3-3σ免疫阳性反应主要位于胞质及胞膜，呈淡黄色至棕黄色。在高、中和低分化的ESCC中14-3-3σ蛋白阳性表达的百分率分别为66.7%、41.3%和24%(图2)；与高分化相比，中、低分化ESCC中14-3-3σ表达显著下降(P< 0.05)；14-3-3σ蛋白表达还与ESCC淋巴结转移和TNM分期呈负相关(P< 0.05)，而与ESCC患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤侵袭深度无显著相关性(表1)。

表1 14-3-3σ蛋白表达与ESCC临床病理特征相关性

*IndicatesP<0.05.

2.3 14-3-3σ与ESCC患者术后生存期相关性

86例ESCC患者术后的5年整体生存率为28.7%；14-3-3σ高表达ESCC患者(24例)的术后生存时间(39.82月)长于低表达或失表达的ESCC患者(62例，28.45月)，14-3-3σ高表达及低表达ESCC患者的5年整体生存期分别为43.31%及24.8%(P< 0.01)。此外，ESCC患者术后的生存期还与性别、TNM分期、淋巴结转移显著相关。

2.4 Cox比例风险回归模型分析

应用Cox单因素比例风险回归模型分析14-3-3σ和临床病理资料对ESCC术后生存期的影响，发现性别、T分期、淋巴结转移、TNM分期、14-3-3σ是影响ESCC预后的重要因素(P< 0.05)(表2)。Cox多因素比例风险回归模型的分析表明： TNM分期和14-3-3σ是影响ESCC预后的独立因素(P< 0.05)(表2)。

3 讨论

14-3-3σ能导致细胞周期G2/M期阻滞，允许受损DNA进行修复，维持基因组稳定性。因而，14-3-3σ具有肿瘤抑制功能，其低表达见于多种肿瘤，如乳腺癌[6]、肝癌[7]、前列腺癌[8]、和鼻咽癌[9]等。14-3-3σ过度表达能够明显抑制鼻咽癌细胞增殖、非依赖性生长和荷瘤裸鼠体内的鼻咽癌细胞生长[10]。中国ESCC中14-3-3σ表达主要定位于细胞质，14-3-3σ低/失表达与淋巴结转移、临床分期显著正相关，与ESCC分化程度呈负相关[11]；而日本ESCC(248例) 中胞核内14-3-3σ高表达与肿瘤浸润深度、临床分期、淋巴结转移显著正相关[12]。与此类似，肺癌、结肠癌和卵巢肿瘤中14-3-3σ的表达模式也不一致。多数的卵巢透明细胞癌中14-3-3σ表达缺失，而89.5%浆液性卵巢癌、90%子宫内膜样卵巢癌、81.8%黏液性卵巢癌中14-3-3σ的表达增高[13]；未转移的卵巢癌中14-3-3σ表达缺失、或中至强阳性表达，而发生邻近器官转移的卵巢癌原发灶和转移灶内14-3-3σ的表达均为强阳性[14]。导致相同组织/器官起源的肿瘤中14-3-3σ表达模式不一致的具体机制尚不十分清楚，可能与地区、遗传、环境、组织学类型、组织处理和肿瘤分期等因素有关。

表2 Cox单因素和多因素风险比例模型分析各变量与ESCC预后关系

*IndicatesP<0.05.

目前临床普遍采用的食管癌TNM分期系统具有一定局限性，导致同一TNM分期的ESCC患者预后不一致；此外，仅50%的肿瘤患者对目前临床上常用的放化疗敏感[15]。因而，需要建立ESCC预后的分子分型系统，为ESCC的临床治疗提供理论依据。本研究表明，14-3-3σ低/失表达ESCC患者的5年整体生存率(24.8%)显著低于14-3-3σ高表达ESCC患者(43.31%)；14-3-3σ是ESCC预后的独立影响因素之一。148例中国ESCC中14-3-3σ表达与预后的相关性，与本研究结果一致[12]；而日本ESCC胞核中14-3-3σ高表达与ESCC预后呈负相关[12]。不仅如此，其他肿瘤也有类似完全相反的结果，提示不同组织起源的肿瘤或相同组织起源但来源不同的肿瘤中14-3-3σ的功能不一，从而导致14-3-3σ表达模式与肿瘤患者预后存在差异。

本研究发现，14-3-3σ表达与TNM分期和ESCC预后呈显著负相关，并且14-3-3σ是影响ESCC预后的独立因素，表明14-3-3σ表达失调是ESCC恶性演进过程中的重要分子事件，为ESCC分子分型及预后评估奠定了理论基础。

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Clinical relevance and correlation with prognosis of14-3-3σ expression in esophageal squamous cell carcinoma

WEI Hua1,2, WANG Ming1, LIU Rui-min1, ZHANG Tian1, MA Jin1, MA Yuan-fang1*, QI Yi-jun1*

(1.Key Laboratory of Cellular and Molecular Immunology, College of Medicine, Henan University;2.Dept. of Endoscopy, Huaihe Hospital, Henan University, Kaifeng 475004, China)

ObjectiveThis study aims to determine the correlation of 14-3-3σ expression with clinical features and its prognostic value in ESCC.MethodsEighty frozen ESCC samples of TNMⅠ to Ⅳ stage stored at -86 ℃ and a tissue microarray containing 86 fixed ESCC samples were used. Western blot was used to examine the 14-3-3σ protein expression in frozen ESCC, and IHC to estimate the 14-3-3σ protein expression in 86 ESCC samples from tissue microarray. The association of 14-3-3σ protein expression with clinical features and ESCC prognosis was determined by Kaplan-Meier curves.Results14-3-3σ immunostaining was located predominantly in the cytoplasm and plasma membrane. 14-3-3σ was positively correlated with differentiation, and negatively with lymph node metastasis and TNM stage(P< 0.05). The average survival time of ESCC patients with 14-3-3σ high and low expression was 39.82 months and 28.45 months, respectively, and the overall 5 year survival rate were 43.31% and 24.8%, respectively (log-rank test, P< 0.01). TNM stage and 14-3-3σ were independent prognostic factors of ESCC.ConclusionsLow/loss protein expression of 14-3-3σ may correlate with poor prognosis of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma; 14-3-3σ; biomarker; prognosis

2014- 03- 24

2014- 05- 30

国家自然科学基金(81072039)

*通信作者(correspondingauthor)：qiyijun@hotmail.com； mayf@henu.edu.cn

1001-6325(2014)08-1044-05

R 735.7

A