不同输液方案对兔肠缺血再灌注损伤小肠细胞凋亡的影响

蔡 舒，毕 春，陈文栋，李 娅，马 莉*

(昆明医科大学 第一附属医院 1.麻醉科； 2.医学检验科, 云南 昆明 650032)

研究论文

不同输液方案对兔肠缺血再灌注损伤小肠细胞凋亡的影响

蔡 舒1，毕 春1，陈文栋1，李 娅2，马 莉1*

(昆明医科大学 第一附属医院 1.麻醉科； 2.医学检验科, 云南 昆明 650032)

目的观察限制性输液和开放性输液对兔肠缺血再灌注损伤小肠细胞凋亡的影响。方法70只日本大白耳兔随机分成3组，对照组(control，n=10)、肠缺血再灌注损伤(IRI)限制性输液组(RFG，n=30)、肠IRI开放性输液组(LFG，n=30)，然后于肠IRI后24、48和72 h各处死10只(n=10)，取小肠回盲部用TUNEL法检测小肠细胞凋亡，用qRT-PCR检测其凋亡基因Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表达。结果兔肠缺血再灌注后3个时间点RFG小肠细胞的凋亡数明显少于LFG(P<0.01)。Bcl-2的表达水平RFG明显高于LFG(P<0.01)，而促凋亡基因Bax的表达低于LFG(P<0.01)。结论与开放性输液方案相比，限制性输液方案能减轻兔肠缺血再灌注损伤，减少小肠细胞凋亡。

肠缺血再灌注；限制性输液；开放性输液；小肠细胞凋亡

围手术期液体治疗与术后并发症密切相关，恰当的液体治疗方案不仅需要维持围手术期患者生命体征平稳以及内环境稳定，而且还要有利于术后的康复[1- 3]。近年提出的早期限制性液体复苏，是容量复苏的革命性概念，在创伤休克领域已得到广泛应用[4- 5]。术中限制输入液体可明显减少腹部大手术患者术后的输液量和液体正平衡量，具有降低促炎性细胞因子、改善机体免疫功能的作用。因此，限制性输液方案更适用于围手术期尤其是腹部大手术患者[6- 7]，限制性输液方案的合理性、科学性也正基于此。因此，选择兔肠缺血-再灌注损伤模型，来研究在术中行限制/开放输液对手术后恢复的关键时期兔肠上皮细胞受损及凋亡的影响，为制定围手术期液体治疗方案提供确实可靠的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

乳酸林格液和罗氏TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche公司)，Trizol RNA提取试剂盒(Promega公司)，引物合成(上海生工生物技术公司)，SYBR premix实时定量扩增试剂(Roche公司)。

1.2 实验动物

SPF级70只日本大白耳兔，雄性，体质量2.5～3.5 kg，由昆明医科大学动物中心提供(合格证号：KUMM2011001)。

1.3 建立模型

建立兔肠缺血再灌注模型，耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠基础麻醉。耳缘静脉开放输液通道输注乳酸林格液。腹部正中切口，暴露并分离肠系膜上动脉，用夹闭其根部60 min，松开血管夹恢复肠系膜血流再灌注2 h，制成模型。模型成功后回纳肠管后分2层关腹，麻醉清醒后继续正常喂养。

1.4 实验分组

将70只兔随机分为3组：1)对照组(control，n=10)，不做任何处理直接处死，取小肠回盲部10 cm 处2段。2)限制性输液组(RFG，n=30)：建立模型，麻醉手术期间输乳酸林格液6 mL/(kg·h)。于术后24、48和72 h分别处死10只，同样取小肠回盲部10 cm处2段。3)开放性输液组(LFG，n=30)：建立模型，麻醉手术期间输乳酸林格液14 mL/(kg·h)，其他同RFG。

1.5 TUNEL法检测小肠细胞的凋亡

分别于模型建立好后即术后的24、48和72 h取得小肠3～5 cm用4%多聚甲醛固定24 h后,进行常规制片，用TUNEL法检测细胞的凋亡数，最后在荧光显微镜200倍镜下随机选取10个视野进行计数。

1.6检测小肠黏膜中凋亡相关基因Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表达

取得另一段小肠通过刮片法获得肠黏膜组织，放于液氮中保存[8]。需要时取30～50 g的组织用液氮研磨成均匀的小颗粒后，用Trizol RNA提取试剂盒提取RNA，再进行反转录，实时定量荧光PCR(qRT-PCR)检测其Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表达水平据熔解曲线计算2-ΔΔ值(表1)。

表1 引物的主要参数Table 1 Primers used to amplify mRNAs

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 实验兔基础情况比较

经单因素方差分析，3组兔的体质量无差异。

2.2 术中不同的输液方案对小肠细胞凋亡的影响

RFG术后24、48和72 h的细胞凋亡数明显少于LFG(P<0.01)。在RFG术后3个时间点随着时间推移细胞的凋亡数逐渐减少，但在LFG术后48 h的细胞凋亡数均高于24和72 h这两个时间点(P<0.05)(表2，图1)。对照组(control)的细胞凋亡数与RFG术后72 h的相近，两组的细胞凋亡数无统计学差异(表2，图1)。

A.TUNEL-positive intestinal cells in control；B.In RFG, at postoperative 24 hours；C.in LFG, at postoperative 24 hours；D.in RFG, at postoperative 48 hours；E.in LFG, at postoperative 48 hours；F.in RFG, at postoperative 72 hours；G.in LFG, at postoperative72 hours; TUNEL-positive intestinal cells in LFG were more than RFG; restrictive fluid management could reduce intestinal apoptosis after intestinal IRI (green fluorescence labeling of fragmented DNA)

图1 TUNEL法检测各组的细胞凋亡Fig 1 TUNEL-positive intestinal cells in each group control(×200)

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with RFG.

2.3 RT-qPCR检测各组Bcl-2和Bax的表达

RFG术后48和72 h Bcl-2的表达明显高于LFG(P<0.05)。RFG术后24、48和72 h Bax的表达明显低于LFG。(P<0.05)LFG术后48 h的Bax的表达均高于24和72 h(P<0.05)(表3,4，图2)。

3 讨论

本实验兔肠缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)中，限制性输液组(restrictive fluid group,RFG)小肠细胞的凋亡数较开放性输液组(liberal fluid group,LFG)少。则限制性输液在兔肠IRI时对小肠起到了一定的保护作用。肠道对缺血再灌注损伤比较敏感，可能当肠细胞发生大量凋亡时致使肠道的黏膜损伤、肠道屏障遭到破坏。限制性输液即在确保机体有效循环血量和血流动力学基本稳定以及重要器官有效灌注与氧合的前提下适当限制液体输入总量，以降低术后并发症和病死率[8- 9]。肠道黏膜屏障由肠黏膜机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障组成， 同时又通过各自的信号通路有机地结合在一起，共同防御外来抗原物质对机体的侵袭。正常情况下，肠道通过肠黏膜上皮屏障有效地防止细菌及其毒素越过肠黏膜屏障。

表3 RT-qPCR检测各组Bax的2-ΔΔ值

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with RFG.

表4 RT-qPCR检测各组Bcl-2的2-ΔΔ值

*P<0.05 compared with control.

图2 Bax,Bcl-2,GAPDH熔解曲线Fig 2 Melting curve of Bax,Bcl-2,GAPDH

本实验结果发现：在LFG中术后48 h细胞凋亡最多，高于24和72 h这两个时间点，这一变化趋势与促凋亡基因Bax在mRNA上的表达水平的变化相同。这更加能够说明与RFG相比，开放性输液方案不能对肠缺血再灌注损伤形成有效的保护。

有研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)该家族参与细胞增殖、分化和凋亡等一系列生理病理过程。其中JNK/SAPK、P38 MAPK两条通路可被(如渗透压变化、内毒素、紫外线、放射线和细胞因子等)应激活化进而调节细胞代谢[10]。激活的JNK/SAPK和P38 MAPK途径可以启动凋亡程序诱发细胞凋亡[11- 12]。本实验的结果提示：限制性输液基本保持了体内原有的稳定的渗透压水平，更接近正常时体内的循环总量，从而较少的引起细胞凋亡是更加适宜的液体治疗方案。相反，开放性输液增加了循环量相当于稀释了体液使得体内渗透压明显降低，这种明显渗透压变化直接或间接可能会激活JNK/SAPK或P38 MAPK的信号途径，从而诱导了细胞凋亡，而造成肠黏膜屏障的破坏。为了证明这一假设，这一课题就有了后续进行的可能性，未来的实验可以对小肠细胞进行体外的渗透压改变的实验，进一步检测相关蛋白，如P38等的表达变化，深入研究P38 MAPK 信号传导通路与Bcl-2、Bax 在细胞凋亡中的关系，有助于进一步阐明细胞凋亡的机制，从而阐明在肠缺血再灌注损伤中限制性输液的保护性的机制，为围手术期发生肠缺血再灌注损伤时制定更优化的输液方案。

[1] Bamboat ZM, Bordeianou L。 Perioperative fluid management[J]. Clin Colon Rectal Surg, 2009,22:28- 33.

[2] Blikslager AT, Moeser AJ, Gookin JL,etal. Restoration of barrier function in injured intestinal mucosa[J]. Physiol Rev, 2007,87:545- 64.

[3] Hilton AK，PeHegrino VA，Scheinkestel CD．Avoiding cominon problems associated with intravenous fluid therapy[J]．Med J Aust,2008,189:509- 513．

[4] LIU LM, Hu DY, Chen HS,etal. The effect of different volumes of fluid resuscitation on traumatic-hemorrhagic shock at high altitude in the unacclimated rat[J]. Shock, 2004, 21:93- 96.

[5] Zhang Y, Gao B, Wang J,etal. Effect of Hypotensive Resuscitation with a Novel Combination of Fluids in a Rabbit Model of Uncontrolled Hemorrhagic Shock[J]. PloS one, 2013, 8: e66916.

[6] Kolsen-Petersen JA, Bendtzen K, Tonnesen E. Infusion of hypertonic saline before elective hysterectomy: effects on cytokines and stress hormones[J]. Br J Anaesth, 2008,100:478- 484.

[7] Charalambous MP, Swoboda SM, Lipsett PA. Perioperative hypertonic saline may reduce postoperative infections and lower mortality rates[J]. Surg Infect (Larchmt),2008,9:67- 74.

[8] Vretzakis G, Kleitsaki A, Stamoulis K,etal. Intra-operative intravenous fluid restriction reduces perioperative red blood cell transfusion in elective cardiac surgery, especially in transfusion-prone patients: a prospective, randomized controlled trial[J]. J Cardiothorac Surg, 2010, 24:5- 7.

[9] Challand C, Struthers R, Sneyd JR,etal. Randomized controlled trial of intraoperative goal-directed fluid therapy in aerobically fit and unfit patients having major colorectal surgery[J]. Bri J Anaesth, 2012, 108: 53- 62.

[10] Yu JW, Farias A, Hwang I,etal. Ribotoxic stress through p38 mitogen-activated protein kinase activatesinvitrothe human pyrin inflammasome[J]. J Biol Chem, 2013, 288: 11378- 11383.

[11] Han X, Xu B, Beevers CS,etal. Curcumin inhibits protein phosphatases 2A and 5, leading to activation of mitogen-activated protein kinases and death in tumor cells[J]. Carcinogenesis, 2012, 33: 868- 875.

[12] Tsai KH, Wang WJ, Lin CW,etal. NADPH oxidase-derived superoxide Anion-induced apoptosis is mediated via the JNK-dependent activation of NF-κB in cardiomyocytes exposed to high glucose[J]. J Cell Physiol, 2012, 227: 1347- 1357.

The effect of different transfusion protocalson intestinal apoptosis in rabbit intestinal ischemia-reperfusion injury

CAI Shu1, BI Chun1, CHEN Wen-dong1, LI Ya2，MA Li1*

(1.Dept. of Anesthesiology；2.Dept. of Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of KunmingMedical University, Kunming 650032,China)

ObjectiveTo investigate the effect of different transfusion protocals(restrictive fluid and liberal fluid) on intestinal apoptosis in rabbit intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI).MethodsSeventy male rabbits were randomly allocated into three groups, normal control group (NCG,n=10), intestinal IRI restrictive fluid group (RFG,n=30), intestinal IRI liberal fluid group (LFG,n=30), 24, 48 and 72 h after intestine IRI separately rabbits were killed (n=10). Intestine was cut to detect intestinal apoptosis by TUNEL and the expression of Bcl-2， Bax by q-RT-PCR were detected.ResultsThe number of intestinal apoptosis after intestinal IRI in restrictive fluid group was significantly lower than that in liberal fluid group(P<0.01). Anti-apoptosis gene Bcl-2 in RFG was higher than that in LFG(P<0.01), while pro-apoptosis gene Bax in RFG was less than LFG(P<0.01).ConclusionsThe effect restrictive fluid on intestine is mild than LFG, which may be potentically explained by apoptosis of much less.

intestinal ischemia-reperfusion injury; restrictive fluid; liberal fluid; intestinal apoptosis

2013- 06- 13

2013- 11- 26

国家自然科学基金(81060159)

*通信作者(correspondingauthor)： supermali123@sina.com

1001-6325(2014)08-1032-05

R 614.2

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