Roux-en-Y胃旁路术对2型糖尿病大鼠肾脏糖异生的影响

2014-11-27张少华陈振宇闫洪涛汤礼军

基础医学与临床 2014年5期

关键词：糖异生旁路肾脏

文艺，冯犁，张少华，陈振宇，闫洪涛，陈涛，汤礼军*

(1.第三军医大学研究生管理大队，重庆 400038；2.成都军区总医院全军普通外科中心，四川成都 610083)

研究论文

Roux-en-Y胃旁路术对2型糖尿病大鼠肾脏糖异生的影响

文艺1，冯犁2，张少华2，陈振宇2，闫洪涛2，陈涛2，汤礼军2*

(1.第三军医大学研究生管理大队，重庆 400038；2.成都军区总医院全军普通外科中心，四川成都 610083)

目的研究胃旁路术对2型糖尿病大鼠肾脏糖异生的影响，探讨其可能的降糖机制。方法建立2 型糖尿病大鼠模型，将大鼠随机分为：对照组，糖尿病模型组，假手术组和手术组。分别于术前及术后4周检测各组大鼠总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和游离脂肪酸(FAA)；术前及术后1、2和4周，检测各组大鼠空腹胰岛素，行口服糖耐量实验(OGTT)，计算血糖浓度-时间曲线下面积(AUC)和胰岛素敏感指数(ISI)。术后4周，采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot杂交技术检测肾脏组织中糖异生关键酶：葡萄糖6磷酸酶(G-6-P)和磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)的mRNA表达及蛋白含量。结果术后4周，手术组大鼠较糖尿病模型和假手术组血脂相关指标降低(Plt;0.05)，空腹血糖及OGTT 2 h血糖值明显下降(Plt;0.05)，AUC明显减小(Plt;0.05)，ISI明显升高(Plt;0.05)，手术组G-6-P和PEPCKmRNA的表达及蛋白含量较糖尿病模型组和假手术组均有降低(Plt;0.05)。结论胃旁路术能显著降低糖尿病大鼠血糖，改善异常的糖耐量，其降糖机制可能与肾脏糖异生关键酶表达降低，肾脏糖异生减弱有关。

胃旁路术；Roux-en-Y；糖尿病；肾脏；糖异生

糖尿病已成为威胁人类健康的主要慢性疾病之一，其中90%以上为2型糖尿病。目前以饮食控制和口服降糖药物的治疗方式对血糖的长期控制并不理想,胰岛素的替代治疗也只能解决暂时的问题。相较于传统治疗，以Roux-en-Y胃旁路术为代表的减重手术对2型糖尿病的治疗取得意想不到效果，手术不仅能明显的改善2型糖尿病患者的血糖、胰岛素和糖化血红蛋白，同时也可纠正糖耐量异常和胰岛素抵抗[1]，近期报道[2]手术对2型糖尿病的治疗效果明显优于单纯的药物治疗。然而目前对其确切的降糖机制尚不清楚，有待进一步的实验研究。本研究采用高脂高糖饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素建立大鼠2 型糖尿病模型，观察胃旁路术对肾脏糖异生的影响，对胃旁路术的降糖作用及其可能机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料

SPF级8周龄SD大鼠40只，雄性，体质量170～190 g[简阳达硕动物科技有限公司，许可证号:SCXK(川)2004)]。高脂饲料由基础鼠饲料(72%)、炼猪油(15%)、蔗糖(10%)和蛋黄(3%)按比例搭配制成高脂高糖饲料。

1.2 试剂

链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L、pH 7.4)，胰岛素放免试剂盒(海博研生物科技有限公司)，Trizol(碧云天生物技术研究所)，反转录荧光定量PCR试剂盒(TAKARA R0086A)，全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，山羊抗兔IgG (武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗PEPCK多克隆抗体(Santa Cruz sc-32879)和兔抗G-6-P多克隆抗体(Santa Cruz sc-25840)(圣克鲁斯生物技术公司)

1.3 糖尿病动物模型复制、分组及处理

将大鼠分为对照组(8只)和糖尿病模型动物(32只),对照组动物给予基础饲料，建模动物给予高脂饲料。喂养4周后，禁食12 h，左下腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg[3]。模型稳定1周后，将糖尿病大鼠30只随机分为糖尿病模型组8只，假手术组8只和手术组14只。假手术组行胃窦十二指肠离断原位吻合术，手术组行胃旁路术，大鼠术前禁食12 h，不限饮水，0.5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔内注射麻醉后固定于手术台，无菌条件下，上腹部正中切口长3 cm切开进腹，闭合胃远端，距Treitz韧带10 cm切断空肠，远端肠襻行胃空肠吻合，距胃肠吻合口远端10 cm行空肠侧侧吻合，完成吻合后用甲硝唑溶液5 mL冲洗腹腔后关腹，手术14只，存活4周8只，存活率57.1%。

1.4 检测方法

1.4.1 大鼠血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和游离脂肪酸(FFA)测定：分别于术前及术后4周，采用全自动生化分析仪测定各组大鼠总胆固醇和甘油三酯，ELISA法测定游离脂肪酸。

1.4.2 口服糖耐量实验(OGTT)：术前及术后1、2和4周，禁食12 h后，50%葡萄糖灌胃1.5 g/kg，取大鼠尾尖血分别测定给葡萄糖后0、0.5、1和2 h的血糖值，用梯形法按式AUC=0.25×(0 h血糖浓度+4×0.5 h血糖浓度+3×2 h血糖浓度)计算血糖浓度-时间曲线下面积(area under the curve,AUC)。

1.4.3 大鼠血清Insulin测定：术前及术后1、2和4周，采用放射免疫法测定各组大鼠各时间点空腹血清胰岛素水平。

1.4.4 计算胰岛素敏感指数(Insulin sensitivity index，ISI)：ISI=1/(空腹血糖×空腹胰岛素)，分析时取其自然对数值，即ISI=In(空腹血糖×空腹胰岛素)-1

1.4.5 实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肾脏皮质PEPCK和G-6-P mRNA的表达水平：采用Trizol法提取肾脏皮质总RNA，严格按照试剂操作说明书进行。用Thermo NanoDrop2000分光光度仪检测RNA 的含量和纯度，取A260/A280在1.8～2.1 之间的RNA进行实验。引物由上海生工合成，为相对定量检测mRNA 表达量，用β-actin作为内参(表1)。采用一步法反转录荧光定量PCR试剂盒配制25 μL体系， BIO-RAD C1000进行目标序列扩增，用2-△△Ct法分析磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G-6-P)mRNA 的水平变化。

1.4.6 Western blot检测肾脏皮质PEPCK和G-6-P的蛋白表达：采用BCA法定量总蛋白，取40 μg总蛋白经SDS-PAGE 电泳分离蛋白, 将蛋白转印至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉/TBST室温封闭1 h，封闭后分别加入兔抗PEPCK多克隆抗体(1∶1 000)和兔抗G-6-P多克隆抗体(1∶800)，4 ℃杂交过夜。洗膜后用辣根过氧化物酶酶标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)室温下二抗杂交1 h, 洗膜后用ECL化学发光试剂显色, 暗室曝光成像，应用UVP BioSpectrum 410 Imaging System分析密度并计算。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠Tch、TG、FFA的检测结果

术前与对照组相比，糖尿病模型组Tch、TG和FFA均有明显升高(Plt;0.05)；术后4周，手术组大鼠较糖尿病模型组和假手术组，Tch、TG和FFA均有降低(Plt;0.05)(表2)。

2.2 各组大鼠OGTT实验的检测结果

术前糖尿病模型组空腹血糖及OGTT 2 h血糖均显著高于对照组(Plt; 0.05)；术后，手术组空腹血糖及OGTT 2 h血糖呈明显下降趋势，术后4周其血糖值显著低于糖尿病对照和假手术组(Plt;0.05)(表3)。

2.3各组血糖浓度-时间曲线下面积(AUC)的检测结果

术前糖尿病模型组AUC显著高于对照组(Plt;0.05)；术后，手术组AUC较糖尿病模型组和假手术组显著降低(Plt;0.05)(表4)。

2.4各组大鼠空腹胰岛素和胰岛素敏感指数的检测结果

术前，糖尿病模型组胰岛素敏感指数较对照组明显降低(Plt;0.05)；术后1周，手术组较糖尿病模型组和假手术组胰岛素敏感指数即明显升高，空腹胰岛素水平降低(Plt;0.05)，手术效果一直维持到术后4周(表5)。