RNR3调控重组Lac Z基因酵母细胞对化学诱变原的筛选

葛宜枝，王瑞鲲，王 磊，谢云斌，刘星妍，李湘鸣

(扬州大学 医学院 预防医学教研室， 江苏 扬州 223900)

研究论文

RNR3调控重组LacZ基因酵母细胞对化学诱变原的筛选

葛宜枝，王瑞鲲，王 磊，谢云斌，刘星妍，李湘鸣*

(扬州大学 医学院 预防医学教研室， 江苏 扬州 223900)

目的建立化学致突变物的体外快速筛选方法。方法用PCR法从酵母基因组中扩增RNR3启动子，将其插入到pMP206/ERE报告载体，将该载体转入W303-1A酵母细胞。当化学诱变原作用于酵母细胞时，会诱导β-半乳糖苷酶表达，可对具有DNA毒性的化学物进行筛选。结果许多可造成DNA损伤的化学诱变原可诱导RNR3的表达。使DNA发生烷基化的诱变原(甲磺酸甲脂和瘤可宁)、使DNA发生断裂的诱变原(顺铂、4-硝基-N-氧化喹啉、博来霉素和福来霉素)、抑制DNA合成酶或拓扑异构酶的诱变原(5-氟尿嘧啶、羟基脲和喜树碱)均可诱导RNR3的表达。结论RNR3调控的重组Lac Z报告基因酵母可用于对许多化学诱变原的筛选，筛选过程可在96孔板中进行，因而具有高通量性。

诱变原；酵母；RNR3基因；β-半乳糖苷酶

化学诱变原引起的基因的突变，可能是导致肿瘤发生的主要机制之一。建立一种快速的筛选化学诱变原的方法是预防和治疗肿瘤的关键。传统的致突变检测方法Ames出现假阳性或是假阴性的机率较高[1]，且是针对原核生物，无法进行快速、高通量的化合物的检测。核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase, RNR)是合成脱氧核糖核苷三磷酸的限速酶，正常生长条件下，细胞中几乎检测不到RNR3的表达，当DNA损伤或是合成阻断时可诱导大量RNR3表达[2-3]。许多化学诱变原，与DNA 结合形成DNA 加合物，导致基因的重排、断裂或激活原癌基因，诱发细胞的癌变。酵母具有生长快、生长条件与原核相似、蛋白的翻释加工与哺乳动物细胞相似等特点，因此是较为理想的宿主细胞。可用分子生物学方法构建RNR3调控的酵母报告载体，转化于酵母细胞。当化学诱变原作用于重组酵母细胞时，会通过RNR3诱导LacZ基因的表达，通过测β-半乳糖苷酶的表达量，筛选具有DNA毒性的化学物。

1 材料与方法

1.1RNR3调控的重组LacZ基因酵母细胞的建立

根据相关文献提取酵母基因组[4]，根据GenBanK的DNA序列，用PCR方法扩增RNR3启动子，将其插入到pMP206/ERE酵母报告载体，从而构建成RNR3调控的Lac Z酵母报告载体，命名为pRNR3-Lac Z。用醋酸锂方法转化于酵母细胞W303-1A(基因型为Matα,ade2-1,his3-11,leu2-3,trp1-1,ura3-1)，用SD/-ura培养板筛选阳性克隆，将此酵母细胞命名为W303-1A/RNR3-LacZ。

1.2 实验研究

1.2.1 时间剂量效应：用甲磺酸甲脂(methyl methanesulfonate,MMS，Sigma公司)检测重组酵母细胞的时间剂量效应。从SD/-ura平板挑取酵母克隆，接种于SD/-ura培养液中，30 ℃振荡培养过夜。取10 mL消毒玻璃瓶，加入SD/-ura培养液1.5 mL及振荡培养的酵母培养液0.5 mL，加入用乙醇配制的MMS 10 μL，其浓度见表1，继续振荡培养，于不同时间测β半乳糖苷酶的活性[5]，每个剂量组做3个复孔，结果用诱导倍数表示。

1.2.2 剂量效应:根据MMS的时间剂量效应关系，用不同DNA作用水平的化学诱变原(Sigma公司)对重组酵母细胞作用12 h，进行剂量效应研究。

1)与DNA发生结合的诱变原：①放线菌素D(Actinomycin D):用双蒸水配制，浓度为2×10-1、1×10-1、5×10-2、2.5×10-2、1.25×10-1、6.3×10-3和3.1×10-3和0 mg/L。②溴乙锭 (ethidium bromide，EB)：用双蒸水配制，浓度为25、12.5、6.3、3.1、0.8、0.2、0.05和0 μg/L。

2)使DNA发生烷基化的诱变原:①丝裂霉素C(mitomycin C)：用0.9%氯化钠注射液配制，浓度为5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08和0 mg/L。②甲磺酸甲脂(MMS)：见时间剂量效应。②瘤可宁(chlorambucil，苯丁酸氮芥)：用乙醇配制，终浓度为50、25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8和0 mg/L。

3)使DNA发生断裂的诱变原：①顺铂(cis-Platinum)：用双蒸水配制，终浓度为25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8、0.4和0 mg/L。②4-硝基-N-氧化喹啉(4-nitroquinoline-N-oxide,4-NQO)：用DMSO配制，终浓度为5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08和0 mg/L。③博来霉素(bleomycin)：用0.9%氯化钠注射液配制，终浓度为12.5、6.25、3.1、1.6、0.8、0.4、0.2和0 mg/L。④福来霉素(phleomycin)：用双蒸水配制，终浓度为25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8、0.4和0 mg/L。

4)抑制DNA合成酶或拓扑异构酶的诱变原: ①5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)：用0.9%氯化钠注射液配制，终浓度为2.5×10-1、1.25×10-1、6.2×10-2.、3.1×10-2、1.5×10-2、8×10-3、4×10-3和0 mg/L。②羟基脲(hydroxyurea)：用无菌双蒸水配制，终浓度为912、456、228、114、57、28.5、14.2和0 mg/L。④喜树碱(camptothecin)：用1 mol/L NaOH配制，终浓度为15、7.5、3.75、1.9、0.9、0.5、0.1和0 mg /L。③阿非迪霉素(aphidicolin)：用乙醇配制，终浓度为2.5、1.25、0.625、0.312、0.155、0.08、0.040和0 mg/L。

5)其他生物化学作用:①秋水仙碱(colchicine)：用0.9%氯化钠注射液配制，终浓度为2.5×10-1、1.25×10-1、6.25×10-2、3.1×10-2、1.6×10-2、8×10-3、4×10-3和0 mg/L。

6) 非基因毒性化合物:①刀豆氨酸(canavanine)：用0.9%氯化钠注射液配制，终浓度为50、25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8和0 mg/L。②四环素(tetracycline)：用0.9%氯化钠注射液配制，终浓度为400、200、100、50 000、25、12.5、6.25和0 mg/L。

取96孔细胞培养板，依次加入不同溶剂配制的不同浓度1 μL、150 μL SD/-ura培养液和50 μL、30 ℃振荡培养过夜的W303-1A/RNR3-Lac Z培养液，继续30 ℃振荡培养12 h，测β-半乳糖苷酶的活性。选用各自化学物的溶剂1 μL作为空白对照(0)，余操作同实验组。

1.3 统计学分析

在进行各受试物剂量效应分析时，为消除时间、细胞数量不同对酶活性的影响，用实验组与空白对照组所诱导的酶活性之比即诱导倍数，进行剂量效应分析。判断标准：受试组诱导细胞产生的β-半乳糖苷酶活性为对照组的1.5倍以上时，并具有明显的剂量效应关系时，可判断为阳性。用Excel统计软件分别进行计算和统计制图分析。

2 结果

2.1 时间剂量效应

重组酵母细胞经不同浓度的MMS作用4 h时，开始出现剂量效应关系；作用8 h时，β-半乳糖苷酶表达量呈线性升高；当作用12 h时达高峰，在200 m/L时，β-半乳糖苷酶活性为对照的32倍；当作用的16 h时，虽然在受试浓度范内，所产生诱导倍数均大于2，但多数低于12 h，而且剂量效应曲线呈现先升后下降的变化，高峰位于25 mg/L，在100 mg/L以上组，诱导倍数甚至低于4 h组(表1)。

2.2 剂量效应

放线菌素D和溴乙锭(EB)是属于与DNA发生结合的诱变原。见放线菌素D和EB未对β-半乳糖苷酶产生明显的诱导作用。MMS、丝裂霉素C和瘤可宁同属为DNA烷基化化合物，作用12 h后发现MMS对细胞的β-半乳糖苷酶诱导最强(见时间剂量效应部分)，其次是瘤可宁，而丝裂霉素C在受试浓度范围内，与细胞无明显的剂量效应关系(图1)。

在DNA断裂诱变原中，顺铂与W303-1A/RNR3-Lac Z存在剂量效关，当浓度为25 mg/L时，酶活性为对照组的5倍；博来霉素和福来霉素亦对酶的活性产生诱导作用，后者诱导倍数较高；4-NQO在0.625 mg /L 对β-半乳糖苷酶有一诱导峰(图2)。

表1 MMS于不同时间对W303-1A/RNR3-Lac Zβ-半乳糖苷酶的诱导

图1 与DNA发生结合的诱变原和烷基化的诱变原与W303-1A/RNR3-Lac Z的剂量效应关系Fig 1 Effect of DNA intercalation agents and DNA alky-lation compounds on fluorescent density from W303-1A/RNR3-Lac Z

图2 使DNA发生烷基化的诱变原与W303-1A/RNR3-Lac Z的剂量效应关系Fig 2 Effect of DNA cleavage mutagens on fluorescent density from W303-1A/pRNR3-Lac Z

在抑制DNA合成酶或拓扑异构酶的诱变原中，除阿非迪霉素外，5-氟尿嘧啶(5-FU)、羟基脲和喜树碱与重组细胞有剂量效应关系(图3)。

图3 抑制DNA合成酶或拓扑异构酶的诱变原与W303-1A/RNR3-Lac Z的剂量效应关系Fig 3 Effect of inhibitors of DNA polymerases or topoisomerase on fluorescent density from W303-1A/RNR3-Lac Z

秋水仙碱、刀豆氨酸和四环素在受试浓度范围内，与W303-1A/RNR3-LacZ的β-半乳糖苷酶无明显剂量效应关系(图4)。

图4 非DNA毒性化合物与W303-1A/RNR3-Lac Z的剂量效应关系Fig 4 Effect of other Chemical mutagens on fluorescent density from W303-1A/RNR3-Lac Z

3 讨论

从时间剂量效应关系来看，RNR3调控的重组Lac Z基因酵母细胞，经不同浓度的MMS诱导后，表达量在8～12 h达高峰，以后开始下降，说明细胞的DNA修复能力在不断加强，以抵抗诱变原的损伤，同时细胞启动多种代谢途径，诱变原在各种生物化学因素的作用下逐步失去活性。考虑到不同诱变原对DNA的损伤能力和细胞的毒性不同，在对不同诱变原进行剂量效应研究时，将其时间作用设定为12 h，这与文献报道[6]出现较大的差异，原因主要是研究者目的以及所用的报告基因不同。

DNA毒性化合物通过不同的水平损伤DNA。RNR3对直接损伤或阻断DNA复制的诱变原较为敏感，而对与DNA发生结合的诱原变如放线菌素D、溴乙锭等不敏感，由上述可见，放线菌素D、丝裂霉素C、EB和阿非迪霉素呈阴性结果，而MMS、瘤可宁、顺铂、4-NQO、博来霉素、福来霉素、5-FU、喜树碱和羟基脲(hydroxyurea)呈阳性结果，可见该重组酵母细胞对多数化学诱变原呈现阳性反应，对使DNA发生断裂的毒性化合物较敏感，这与文献报道[6]相一致。

秋水仙素破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期；刀豆氨酸结构与精氨酸相似，所形成蛋白质的功能出现异常；四环素与核蛋白体的30S亚单位结合，抑制蛋白的合成。从对这3种的非基因毒性化合研究结果来看，W303-1A/RNR3-Lac Z与其无剂量效应关系，说明该重组细胞有较好的特异性。

在研究中，重组酵母细胞β-半乳糖苷酶的表达，除与受试物的作用有关外，还会受到细胞的数量和“状态”的影响，通常用细胞密度A600对β-半乳糖苷酶的活性进行校正。由于A600反映是活细胞、“病细胞”和死细胞的总数，所以最好将A600控制在0.25～0.80之间[7]，才能很好地反映细胞的数量，否则会造成较大的误差。

有毒化学物通过多种途径作用于细胞，某些诱变原在一定的浓度时，会对细胞产生一定的毒性或对β-半乳糖苷酶产生抑制作用，如4-硝基-N-氧化喹啉(4-NQO)和瘤可宁等化学物，低浓度时可诱导β-半乳糖苷酶的表达，而在高浓度时，由于对细胞的毒性增加，使得β-半乳糖苷酶的表达下降；溴乙锭在低浓度时，未诱导β-半乳糖苷酶的表达，而在高浓度时，对该酶的表达产生明显的抑制作用。

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Screen for chemical mutagens basedon the recombinant Lac Z gene yeast cells regulated by RNR3 promoter

GE Yi-zhi, WANG Rui-kun, WANG Lei, XIE Yun-bin, LIU Xing-yan, LI Xiang-ming*

(Dept. of Preventive Medicine, Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001, China)

ObjectiveTo develop a fast screening method for chemical mutagens.MethodsRNR3 promoter was amplified using polymerase chain reaction (PCR) from yeast genome and inserted into the yeast report vector of pMP206 / ERE to construct yeastLacZgene report vector regulated byRNR3. This vector was transformed into the yeast cell of W303-1A. When the yeast cell was treated by the chemical mutagenesis, the expression ofLacZgene was induced. So it can be used to screen the chemicals with DNA toxicity by measuring the beta-galactose enzyme activity.ResultsVarious chemicals that cause DNA damaged can induceRNR3 expression. The mutagens alkylating DNA (methyl methanesulfonate and chlorambucil), the cleavages of DNA (cisplatin, 4-nitro-N-oxidation of quinoline, bleomycin and phleomycin) and the inhibitor of DNA polymerase or topoisomerase (5-fluorouracil, hydroxyurea and camptothecin) can induceRNR3 expression.ConclusionsRecombinantLacZreport gene yeast cells regulating byRNR3 can be used for the screening of chemical mutagen and this screen can be carried out in 96 well micro plate as a high throughput technology.

mutagens; yeast cells;RNR3 gene; β-galactosidase

2013-08-27

2013-10-28

*通信作者(correspondingauthor)：847264344@qq.com

1001-6325(2014)05-0679-05

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