miR- 29a和miR- 142- 3p促进髓系分化的基因调控网络

董 贺，马艳妮，董 磊，赵华路，张俊武，王 芳，余 佳

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 国家医学分子生物学重点实验室， 北京 100005)

miR- 29a和miR- 142- 3p促进髓系分化的基因调控网络

董 贺，马艳妮，董 磊，赵华路，张俊武，王 芳，余 佳*

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 国家医学分子生物学重点实验室， 北京 100005)

目的深入了解miR- 29a/miR- 142- 3p参与促进髓系分化的调控网络。方法首先实现miR- 29a和miR- 142- 3p在HL- 60细胞中的过表达，同时使用PMA以及ATRA分别诱导HL- 60细胞向单核及粒系分化。May-Grünwald-Giemsa染色方法观察核形态变化，Real-time PCR检测细胞内CD11和CD14的表达。mRNA表达谱芯片分析获得表达模式相似的基因，利用DAVID和GeneMANIA进行GO categories 和信号通路归类分析。PicTar和TargetScan进行靶基因预测，双荧光报告基因实验确定靶基因的真实性。结果miR- 29a/miR- 142- 3p过表达细胞与PMA/ATRA诱导分化细胞在整体基因表达模式上有较高的相似度，而表达模式相似的基因大多与细胞分化相关，且在GO分析中显著富集。同时，ZBTB5、CaMKK2、SUV420H2、TRIB2和CANX被确定为miR- 29a新的靶基因。结论miR- 29a/miR- 142- 3p通过调节其靶基因活性，引发整个基因表达调控网络的改变，使之趋向于髓系分化过程中的基因表达变化，从而促进髓系分化进程。

miR- 29a； miR- 142- 3p； 髓系分化；基因表达； GO分析

造血是贯穿人一生的重要生理过程,涉及多潜能造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)的自我更新和向不同链系细胞的分化决定并进一步分化发育成熟。HSC首先分化成共同淋巴样祖细胞(common lymphoid progenitor, CLP)和共同髓样祖细胞(common myeloid progenitor, CMP)。CMP进一步分化成巨核/红系双潜能祖细胞(megakaryocytic-erythroid progenitor, MEP)和粒系/单核系祖细胞(granulocyte-monocyte progenitor, GMP)。GMP经过髓样分化细胞限制的途径分化发育成粒细胞、单核细胞，这一过程又称为髓系分化[1- 2]。miRNAs是一类大小约为22 nt RNA序列的转录后调节分子。其主要通过互补结合到靶mRNA 3′非编码区，剪切mRNA或抑制mRNA的翻译，在转录后水平负性调节靶基因表达[3- 4]。miR- 29a与miR- 142- 3p是本实验室已证明的两个促进髓系分化进程的miRNA分子[5]。本研究将通过对基因表达谱的系统性分析和新的靶基因鉴定探究miR- 29a和miR- 142- 3p这两个miRNAs在髓系分化过程中的调控网络，即从整个基因调控网络的角度来阐述miR- 29a和miR- 142- 3p促进髓系分化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HL- 60细胞(中国医学科学院基础所细胞中心)，Trizol及反转录试剂盒(Invitrogen公司),实时定量PCR所用试剂(Takara公司)，转染试剂LIPOFECTAMINETM2000 Reagent(Invitrogen公司)，May- Grünwald染料(Sigma公司)，Giemsa染料(AppliChem公司)，Dharmafect Ⅰ转染试剂、miRNA模拟物(Dharmacon公司)，双荧光检测试剂盒(Promega公司)。

1.2 细胞系的培养及诱导分化

人早幼粒白血病细胞系HL- 60细胞培养于RPMI- 1640培养基中。诱导前1天更换新鲜的完全培养基，第2天向其加入3 μmol/L ATRA诱导向粒系分化，或加入75 ng/mL PMA诱导向单核-巨噬细胞分化。

1.3 HL- 60细胞的转染

转染前1天，以适合密度传代细胞。将5 μL浓度为20 nmol/L的miRNA模拟物以及对应的阴性对照加入200 μL 无血清培养基中混匀，转染试剂Dharmafect Ⅰ加入200 μL 无血清培养基中，室温静置5 min。将混合物直接加入6孔板的细胞中，轻摇混匀，继续培养24～48 h。

1.4 细胞诱导向粒系或单核-巨噬细胞分化的检测

1.4.1 Real time PCR检测细胞内CD11和CD14的表达：方法见1.5 Real time PCR。

1.4.2 May-Grünwald-Giemsa染色观察核形态变化：收集细胞，4 ℃预冷的PBS洗1次，重悬于微量的血清中。 细胞悬液滴于载玻片一侧，盖玻片贴近细胞悬液，快速拉往另一侧，空气中迅速晾干。 甲醇固定10 min。May-Grünwald染液染色5 min，pH 8左右的去离子水洗5 min。 Giemsa染液中染色10 min，再用水洗涂片3遍。 分析单核-巨噬细胞和粒系细胞分化的细胞形态。

1.5Real-timePCR检测细胞内CD11b和CD14的表达/miR-29a和miR-142-3p的表达

在分化的不同时间点或转染后48 h收集细胞，根据Trizol操作说明提取细胞总RNA。提取的总RNA定量后，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链。使用适量的cDNA作为PCR模板，BioRad CFX-96进行PCR反应，SYBR染料实时检测扩增产物的量，以GAPDH为内参(miRNA real-time PCR以U6snRNA为内参)分析基因表达情况。所使用引物序列见表1。

1.6 基因表达谱的分析

1.6.1 基因表达模式相似性的分析：以cutoff=2从基因表达谱数据中筛选出组内差异表达基因，即实验组/对照组大于2，为上调；实验组/对照组小于等于2且大于等于0.5，为不变；实验组/对照组小于0.5，为下调。进而统计miR- 29a/miR- 142- 3p过表达组与诱导髓系分化组表达模式相同的基因数量占miRNA过表达组差异表达基因总数的比例，计算表达模式的相似度。

1.6.2 表达模式相似基因的GO及信号通路的分析：以cutoff=3从基因表达谱数据中筛选出组内差异表达基因，并从中筛选出在miR- 29a/miR- 142- 3p过表达组与诱导髓系分化组中共同上调或下降的基因。将这些基因在DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)中进行Functional Annotation Clustering分析(主要为GO分析)，其中Classification Stringency设定为“高”。这些基因按照具有相似功能的原则被分为若干组，并根据其功能之间的关联性进行排名。对于排名第1的组中的基因进一步通过GeneMANIA(http://www.genemania.org/)进行信号通路分析。

1.7 靶基因的预测

以cutoff=2从miR- 29a过表达细胞的基因表达谱数据中筛选出在miR- 29a过表达后表达没有明显变化或表达下调的基因，并与两个靶基因预测网站(TargetScan和PicTar)所预测的miR- 29a的候选靶基因进行叠加，选择其中与细胞分化或增殖相关的基因作为最终的候选靶基因。

1.8 双荧光报告实验检测miR- 29a的候选靶基因

设计引物包含预测靶基因3′UTR区域的miRNA结合位点(表2)，将 3′UTR区含miR- 29a结合位点的300～500 bp序列克隆插入pmiR- reporter载体中，同时构建含与miR- 29a序列完全互补片段的pmiR- reporter作为阳性对照。所使用引物见表2。0.4 μg pmiR- reporter质粒、0.02 μg pRL-TK与5 pmol/L miRNA模拟物或随机寡核苷酸对照共转染293T细胞，转染48 h后收集细胞，按照双荧光检测试剂盒说明书操作，检测报告基因表达水平。

2 结果

2.1HL-60细胞诱导分化以及miR-29a/miR-142-3p的过表达

如图1A所示，在HL- 60细胞中过表达miR- 29a和miR- 142- 3p，同时分别诱导HL- 60细胞向单核及粒系分化。对诱导分化以及这两个miRNAs过表达后的细胞的整体基因表达模式进行了系统性分析，并对基因表达模式相似的基因进行了深入的GO分析和信号通路分析。另外，鉴定了在这一过程中发挥重要作用的miR- 29a新的靶基因。以期更加深入地了解miR- 29a/miR- 142- 3p参与促进髓系分化的机制。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

表2 双荧光报告基因所用引物Table 2 Primer sequences used for double-luciferase reporter assay

HL- 60细胞经PMA诱导72 h后，细胞形态显著变化，成熟单核细胞比例增加，即细胞系呈肾型，胞质染色青蓝色的细胞比例增加(图1B)，同时单核细胞分化标志基因CD14的表达明显增加(图1C)。HL- 60细胞经ATRA诱导72 h后细胞形态显著变化，成熟粒细胞比例增加，即细胞系呈带状或分叶，核质比明显减小(图1B)，同时粒系分化标志基因CD11b的表达明显增加(图1C)。另外使用miR- 29a和miR- 142- 3p模拟物转染HL- 60细胞，PCR结果显示miR- 29a和miR- 142- 3p均成功过表达(图1D)。

2.2过表达miR-29a/miR-142-3p及PMA/ATRA诱导分化后基因表达模式分析

分析结果显示，向HL- 60细胞转染miR- 29a/miR- 142- 3p模拟物所引起整个基因表达模式的变化确实与HL- 60细胞在PMA和ATRA的诱导下分别向单核和粒细胞方向分化的过程中，所引起的基因表达模式变化有一定的相似性(图2)。过表达miR- 29a与ATRA诱导粒系分化后的HL- 60细胞基因表达模式相似度为16%；过表达miR- 29a与PMA诱导单核分化后的HL- 60细胞基因表达模式相似度为7%；过表达miR- 142- 3p与ATRA诱导粒系分化后的HL- 60细胞基因表达模式相似度为15%；过表达miR- 142- 3p与PMA诱导单核分化后的HL- 60细胞基因表达模式相似度为7%。

图1研究路线与模型建立
Fig1Theoverallstrategyandestablishmentofcellmodels

HA represents HL- 60 cells induced by ATRA; HP represents HL- 60 cells induced by PMA; H29a and H142- 3p represents HL- 60 cells overexpressed miR- 29a and miR- 142- 3p mimic respectively

图2过表达miR-29a/miR-142-3p与PMA/ATRA诱导髓系分化后基因表达模式相似性分析

Fig2ThesimilarityanalysisofgeneexpressionpatternbetweenHL-60cellsinducedbyPMA/ATRAandthecellsoverexpressedmiR-29a/miR-142-3p

2.3 GO与信号通路分析

GO与信号通路分析显示，在ATRA诱导下上调且在miR- 142- 3p过表达组中同样上调的基因，其中涉及白细胞激活这一生物学过程最为显著(图3)。在PMA诱导下上调且在miR- 142- 3p过表达组中同样上调的基因，其中涉及糖胺聚糖的结合这一生物学过程最为显著(图3)。在ATRA诱导下下调且在miR- 142- 3p过表达组中同样下调的基因，其中参与细胞组分形态发生的基因最为显著(图3)。在ATRA诱导下上调且在miR- 29a过表达组中同样上调的基因，其中参与白细胞激活调控的生物学过程最为显著(图3)。在PMA诱导下上调且在miR- 29a过表达组中同样上调的基因，其中涉及多糖连接的生物过程最为显著(图3)。在ATRA诱导下下调且在miR- 29a过表达组中同样下调的基因，其中涉及血管发育这一生物学过程最为显著(图3)。在PMA诱导下下调且在miR- 29a过表达组中同样下调的基因，其中参与磷酸盐代谢过程的调节这一生物学过程最为显著(图3)。上述所涉及的所有基因，通过GeneMANIA对它们之间共表达、共定位、基因互作、通路、物理性互作进行了分析，发现它们功能紧密相关，以网络形式共同行使相关功能(图3)。

2.4 靶基因预测与双荧光报告基因验证

靶基因预测结果如下：过表达miR- 29a组与ATRA诱导组表达变化相似，并与软件预测结果叠加后，共预测76个miR- 29a的候选靶基因(图4)，其中12个基因为miR- 29a已报道的靶基因，且这些基因大部分集中在整个预测靶基因的排名中前列，说明了此预测方法的有效性；过表达miR- 29a组与PMA诱导组表达变化相似，并与软件预测结果叠加后,共预测88个miR- 29a的候选靶基因(图4)，其中13个基因为miR- 29a已报道的靶基因，且这些基因同样集中在整个预测靶基因排名的前部分。这两部分预测的靶基因有大部分的重叠，根据这些靶基因的已知功能，筛选了9个与细胞分化、增殖或凋亡相关的候选基因进行了实验验证。 图5A显示了这9个靶基因3′UTR区miR- 29a的结合位点。通过报告基因实验证明了miR- 29a的过表达能够抑制包含ZBTB5、CaMKK2、SUV420H2、TRIB2和CANX3′UTR区的报告基因的表达(图5)。

3 讨论

miRNAs是非编码RNA中研究最为深入、作用机制相对明确的一大类调控分子，其功能广泛，几乎涉及生命活动的各个方面[6- 8]。本实验室在此之前已对miR- 29a和miR- 142- 3p的功能与分子机制做过研究，本研究进一步从整个基因调控网络的角度阐述了miR- 29a和miR- 142- 3p促进髓系分化的分子机制。

通过对上述数据的分析处理发现，过表达miR- 29a/miR- 142- 3p所引起的基因表达模式变化与在PMA/ATRA诱导下向单核/粒细胞分化所引起的基因表达模式变化有一定的相似性。在miR- 29a/miR- 142- 3p过表达组中上调或下调的很多基因，在PMA/ATRA诱导组同样上调或下调。说明miR- 29a/miR- 142- 3p可能通过调控这些与分化相关的基因的表达促进HL- 60细胞向单核和粒细胞分化。进一步的GO分析显示，这些基因均参与一些能够直接或间接影响髓系分化的生物学过程，例如激活白细胞、糖胺聚糖的连接[9]、细胞组分形态发生、调节磷酸盐代谢[10]等过程，且它们能够集成网络，共同参与同一生物学过程。这些结果说明miR- 29a/miR- 142- 3p通过这些与细胞分化相关的调控网络调节HL- 60细胞的髓系分化。本实验还鉴定了miR- 29a 5个新的靶基因，即ZBTB5、CaMKK2、SUV420H2、TRIB2和CANX。其中，ZBTB5为POK家族转录因子之一，有研究已证明其可通过抑制细胞周期阻滞基因P21的表达激活细胞增殖[11]。CaMKK2为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，有研究表明CaMKK2可抑制髓系分化，阻碍粒系呈递[12]。SUV420H2编码组蛋白甲基转移酶，其可作为一个甲基化“开关”促进成肌分化[13]。TRIB2为Tribbles家族3成员之一，已有报道称Tribbles家族成员可共同促进C/EBPalpha的降解，而后者为一种转录因子，突变后可诱发急性髓系白血病[14]。CANX为钙联接蛋白，可参与抑制细胞凋亡[15]。因此，miR- 29a除已知报道的靶基因之外，还可能通过上述5个与髓系分化相关的靶基因参与调控髓系分化过程。但这5个靶基因与miR- 29a之间的关系以及这5个靶基因在髓系分化过程中的功能还需要进一步研究。

HA:ATRAinduced; HP:PMA-induced; H29a:overexpressed miR-29a; H142-3P:overexpressed miR-142-3P

A.HAvsH29a; B.HPvsH29a; C.HAvsH142-3P; D.HPvsH142-3P; HA:ATRA-induced; HP:PMA-induced; H29a:overexpressed miR-29a; H142-3P:overexpressed miR-142-3P

图4靶基因预测统计结果
Fig4Statisticalresultoftargetgenesprediction

图5miR-29a靶基因验证
Fig5TheverificationofmiR-29atargetgenes

综上所述，本研究发现miR- 29a/miR- 142- 3p过表达可引发整个基因表达调控网络的改变，使之趋向于髓系分化过程中的基因表达变化，从而促进髓系分化进程。这些结果有助于深入理解髓系分化过程的本质以及miR- 29a/miR- 142- 3p参与促进髓系分化的分子机制。

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The regulatory network in myeloid differentiation promoted by miR- 29a and miR- 142- 3p

DONG He, MA Yan-ni, DONG Lei, ZHAO Hua-lu, ZHANG Jun-wu, WANG Fang, YU Jia*

(Dept. of Biochemistry, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS,School of Basic Medicine, PUMC, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo find the regulatory network of myeloid differentiation promoted by miR- 29a/miR- 142- 3p deeply.MethodsFirstly, miR- 29a and miR- 142- 3p were overexpressed in HL-60 cells meanwhile HL- 60 cells were also induced towards monocyte and granulocyte differentiation using PMA and ATRA respectively. To observe the nuclear morphometry change and utilize real time PCR to detect the expression ofCD11 andCD14 in cells. Genes which possessed similar expression pattern were obtained by microarray and analyzed for their similarities. Analyzed by GO and signal pathway clustering using DAVID and GeneMANIA. Utilizing PicTar and TargetScan, predicted new targets of miR- 29a which were also verified by double-luciferase reporter assay.ResultsMany differential expressed genes during ATRA/PMA induced myeloid differentiation or in the cells with miR- 29a/miR- 142- 3p overexpression were similar. Significantly enriched genes in GO analysis which also possessed similar expression patterns were almost associated with cell differentiation.ConclusionsmiR- 29a and miR- 142-3p regulate the activity of their targets, triggered global gene expression change so as to make it closer to that during myeloid differentiation and then promoted myeloid differentiation.ZBTB5,CaMKK2,SUV420H2,TRIB2 andCANXmay play an important roles in myeloid differentiation promoted by miR- 29a.

miR- 29a; miR- 142- 3p; myeloid differentiation; gene expression; GO analysis

2014- 02- 28

2014- 04- 23

科技部重大科学问题导向项目(2011043)

*通信作者(correspondingauthor)：j-yu@ibms.pumc.edu.cn

1001-6325(2014)07-0896-08

研究论文

Q 254

A