丁苯酞对脑缺血再灌注大鼠HSP70及TLR4的影响研究

张晓璇 邱海鹏 赵淑敏(河北承德附属医院神经内科一病区，承德 067000)

缺血再灌注损伤在脑缺血疾病中非常常见，其对脑组织的损伤程度远超过单纯的脑组织缺血［1］，而其损伤机制主要与再灌注下的氧自由基生成增多，炎症反应的亢进及细胞凋亡的改变有关［2］。因此在缺血性疾病中，调控细胞凋亡和控制炎症反应能够显著地改善再灌注所导致的组织损伤，从而保护神经功能，这已经成为脑缺血性疾病治疗中的重要方向［3］。已有大量研究证实 HSP70(Heat shock protein，热休克蛋白的一种)能够抑制细胞的凋亡和坏死，并可激活TLR4(Toll-like receptor 4，Toll样受体)，而TLR4的激活可直接触发机体的炎症应答反应，导致了缺血再灌注损伤［4］。NBP(Butylph-thalide，丁苯酞)在缺血再灌注损伤中的应用疗效非常令人满意，其能有效地保护神经功能，但具体机制仍没有定论。本研究即是探讨在NBP预处理对于缺血再灌注模型大鼠的HSP70和TLR4的表达有着怎样的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 144只清洁级健康成年雄性SD大鼠(天津山川红实验动物中心提供，动物许可证号为:SCXK(津)2009-0001)，体质量在220～260 g之间。

1.1.2 药品和仪器 本研究中所涉及的主要药品及仪器包括:NBP(丁苯酞)由石药集团恩必普药业有限公司生产，H20050299;TUNEL(细胞凋亡检测试剂盒)由上海晶天生物公司提供;SP免疫组化试剂盒、兔抗鼠HSP70、TLR4抗体均购自北京博奥森生物公司;水合氯醛、多聚甲醛、乌拉坦均由天津市福晨化学试剂厂生产;医学图像分析系统及光学显微镜均由成都泰盟公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 将144只实验大鼠随机分成:Sham组(假手术组)、IR组(缺血再灌注组)、NBP组(给予NBP干预的缺血再灌注组)3组各48只，各组再根据缺血2 h后再灌注的时间按6、12、24和48 h分为4个小组，每小组各12只。NBP组为建立缺血再灌注模型后立即给予80 mg/kg NBP灌胃，每日一次。而Sham和IR组作为对照组，给予与NBP量相等的生理盐水来灌胃。

1.2.2 建立模型 IR组和NBP组缺血再灌注大鼠模型的建立通过Zea Longa改良方法。用10%的水合氯醛进行麻醉，剂量为300 mg/kg，栓塞MCA(大脑中动脉)，缺血时间为2 h，再灌注分为6、12、24和48 h。IR组和NBP组鱼线插入颈内动脉约17～18 mm，闭塞大脑中动脉，而Sham组鱼线仅插入颈内动脉约8～10 mm，并不对大脑中动脉进行闭塞。

1.2.3 神经功能缺损评分 大鼠缺血再灌注模型完成后，待大鼠清醒，根据Zea-longa标准行大鼠的神经功能缺损评分［5］，具体评分标准如下:0分为行动如常、无症状;1分为出现的神经功能缺失症状为轻度(提大鼠尾可见左前肢屈曲);2分为出现的神经功能缺失症状为中度(大鼠向左侧旋转);3分为出现的神经功能缺失症状为重度(大鼠运动向左侧倾倒);4分为大鼠丧失意识。

1.2.4 制备标本 在各计划时间点将大鼠腹腔注射乌拉麻醉。开胸，暴露心脏，左室予生理盐水洗净后予多聚甲醛固定。开颅取脑组织(视交叉前后约2 mm)固定脱水，行石蜡块包埋，切片(厚约2 μm)备用。

1.2.5 检测细胞凋亡(TUNEL法) TUNEL染色方法主要包括石蜡切片脱蜡，PBS洗涤，TUNEL混合液37℃ 60 min孵育，PBS洗涤，加转化剂POD，加DAB显色液，苏木精复染等。将切片在250倍荧光显微镜下观察、分析，在缺血部位海马CA1区取并不重叠的视野6个，并采用病理彩色图像分析系统观察，统计凋亡细胞数(棕黄色荧光者)，取平均值。

1.2.6 免疫组化染色 用SP法将切片脱蜡，过氧化氢孵育约15 min，PBS洗涤，在2 min的高压抗原修复后分别滴加 HSP70和 TLR4的抗体(均为1∶150)，37℃孵育2 h;PBS洗涤后分别滴加二抗工作液，37℃孵育30 min;再次用PBS洗涤后予DAB显色脱水，然后复染并封片。400倍光镜下观察并计算缺血部位海马CA1区HSP70和TLR4染色阳性细胞数(取不重复的视野5个，取均值)。

1.2.7 Western blot检测HSP70和TLR4蛋白表达水平 缺血再灌注7 d后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，经心尖灌注生理盐水后取缺血侧海马组织标本，使用组织总蛋白提取试剂，根据说明书步骤进行核和胞浆蛋白的提取，用于HSP70和TLR4的表达检测，BCA法蛋白定量，取蛋白样品50 μg，电泳后转膜，5% 的脱脂奶粉封闭 1 h，β-actin、HSP70 和TLR4抗体用5%牛奶稀释(1∶200)，4℃过夜，TBST洗膜，5%的牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，洗膜后，按照ECL说明书，1∶1配置发光工作液，凝胶成像仪成像，Image J软件进行灰度分析。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，比较采用t检验。P＜0.05定义为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分的比较 Sham组的大鼠神经功能缺损评分均为0。IR组和NBP组不同灌注时间下各分组的大鼠神经功能缺损评分详见表1。结果提示:再灌注时间为12、24和48 h时，NBP组的神经功能缺损评分均低于IR组(P均＜0.05)。

2.2 细胞凋亡比较 Sham组、IR组、NBP组在不同灌注时间下各分组的大鼠大脑皮层细胞凋亡数量详见表2和图1(凋亡细胞数为单个高倍镜视野下的数量，6个视野取均值)。结果提示:IR、NBP组任意灌注时间段的凋亡细胞数均显著高于Sham组(P均 ＜0.01)，灌注时间为6、12、24、48 h 时，NBP 组的细胞凋亡数均显著低于IR组(P均＜0.01)。

表1 IR和NBP组不同灌注时间下神经功能缺损评分比较Tab.1 Comparison of neurological deficit scores in IR and NBP group with different perfusion time

2.3 各组大鼠HSP-70阳性细胞数比较 Sham组、IR组、NBP组在不同灌注时间下各分组的大鼠HSP-70阳性细胞数目详见表3。结果提示:IR、NBP组任意时间段的HSP-70阳性细胞数目均显著高于Sham组(P均＜0.01)，同样，IR组任意灌注时间段的HSP-70阳性细胞数目均显著高于NBP组(P均＜0.01)。

2.4 各组大鼠TLR4阳性细胞数比较 Sham组、IR组、NBP组在不同灌注时间下各分组的大鼠TLR4阳性细胞数目详见表4。结果提示:IR、NBP组任意时间段的TLR4阳性细胞数目均显著高于Sham组(P均＜0.01)，同样，IR组任意灌注时间段的TLR4阳性细胞数目均显著高于NBP组(P均＜0.01)。

表2 不同灌注时间下各组细胞凋亡比较Tab.2 Apoptosis of cell in each group at different perfusion time

图1 灌注48 h后各组脑组织TUNEL染色代表性图片(TUNEL阳性结果为胞核棕色)Fig.1 Representative picture of TUNEL stained brain tissue in each group after perfusion for 48 h

表3 不同灌注时间下各组大鼠HSP-70阳性细胞数比较Tab.3 Comparison HSP-70 positive cells in rats at different perfusion time in each group

表4 不同灌注时间下各组大鼠TLR4阳性细胞数比较Tab.4 Comparison TLR4 positive cells in rats at different perfusion time in each group

表5 灌注48 h后三组TLR4和HSP70表达的Western blot检测结果灰度分析Tab.5 Grayscale analysis of Western blot test results of Hsp70 and TLR4 expression after infusion for 48 h in three groups

图2 灌注48 h后三组TLR4和HSP70表达的免疫组化检测结果Fig.2 Results of immunohistochemical detection of HSP70 and TLR4 expression in three group after infusion for 48 h

图3 灌注48 h后三组TLR4和HSP70表达的Western blot检测结果Fig.3 Western blot test results of HSP70 and TLR4 expression after infusion for 48 h in three groups

2.5 灌注48 h后三组TLR4和HSP70的表达 与Sham组相比，再灌注后48 h，HSP70和TLR4的表达明显升高(P＜0.05);NBP可以明显降低TLR和HSP70的表达(P＜0.05)。见表5和图2、3。

3 讨论

脑组织细胞对缺血非常敏感，若缺血时间较长，则会导致脑组织神经细胞的不可逆性损伤。而缺血再灌注所致的损伤更为严重，这与缺血再灌注状态下氧自由基的生成增多、炎症反应的亢进及细胞凋亡的改变有着密切的联系［6］。NBP(丁苯酞)在缺血再灌注损伤中的应用疗效已有大量相关研究，同样本研究结果发现给予NBP预处理的大鼠神经功能缺损评分明显低于IR组，肯定了NBP在改善缺血再灌注所致神经功能损伤中的作用，并且改善的程度与再灌注时间及开始给予NBP的时间有着显著的关系［7］。本研究探讨了NBP预处理对于缺血再灌注模型大鼠的HSP70和TLR4表达的影响，结果发现在本研究中的任意灌注时间段内，NBP和IR组的凋亡细胞数均显著高于Sham组，提示了在缺血再灌注大鼠模型中，细胞的凋亡数目显著增多。国际上曾有研究证实导致缺血再灌注受损的机制之一是细胞凋亡的改变，上述研究结果与此结果恰好相吻合。而NBP组的细胞凋亡数均显著低于IR组，提示在NBP的作用下，缺血再灌注模型的细胞凋亡增加状况有所改善。而热休克蛋白HSP70本身能够抑制细胞的凋亡和坏死，还能够通过激活TLR4，进而激发机体的炎症反应［9］，产生大量的炎症介质和氧自由基，对神经细胞产生损伤［10］。本研究中同样证实了NBP、IR组的HSP70和TLR4阳性细胞数显著高于Sham组，而NBP组的HSP70和TLR4阳性细胞数也显著低于IR组，证实了在缺血再灌注模型中，大鼠的HSP70和TLR4表达均受到了抑制［11］，而给予NBP处理后的凋亡细胞数显著减少，但距离Sham假手术组还有一定的差异。

综上，结合我们的研究结果发现，NBP可以抑制HSP70和TLR4(高表达的细胞不一定是凋亡细胞)的表达，降低细胞的凋亡数和机体炎症反应，从而起到保护神经功能的作用。

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