苯扎贝特对原发性胆汁性肝硬化患者外周血CD4+T细胞的抑制作用研究①

陈曲波 彭桉平 黎翠翠 赵 蓉 卢欣沂 何 敏 周丽敏 吴炜霖

(广州中医药大学第二临床医学院免疫室，广州 510120)

原发性胆汁性肝硬化(PBC)是由自身免疫机制介导的，以肝内小胆管进行性、非化脓性炎症为特征的慢性胆汁淤积性疾病，并进一步发展为肝纤维化、肝硬化，最终导致肝功能衰竭。尽管PBC的病因和发病机制还不清楚，但有许多证据表明自身反应性T细胞参与发病，并对胆小管破坏起重要作用。研究显示在原发性胆汁性肝硬化患者肝脏组织存在显著的T细胞浸润，尤其在汇管区浸润的T细胞中以CD4+T细胞为主，表现为增强的Th1、Th17细胞介导的自身免疫反应及低下的Treg细胞反应［1］。传统降脂药苯扎贝特能降低PBC患者外周血Fas抗原阳性 T细胞的比率，具有一定程度的抗炎作用［2］。一些对熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)耐药的PBC患者使用BF单一疗法，有50%可达到很好疗效，且UDCA联合BF治疗可使大多数病人的生化和免疫指标达到正常水平，明显改善临床症状，且没有任何的副作用，故BF联合UDCA可能对UDCA耐药的PBC患者是一种有效的治疗方法［3］，但其免疫抑制机制不清楚。本研究通过BF体外干预PBC患者CD4+T细胞增殖和分化，阐述其免疫抑制作用机理，为临床应用BF提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 PBC患者15例，女性12例，男性3例，平均年龄(66.5±16.8)岁，均来自2010年12月至2011年10月就诊于广东省中医院的门诊或住院病例。PBC组入选标准参考2009年欧洲和美国同时制定的新指南:①临床出现胆汁淤积症状，如黄疸、皮肤瘙痒、疲劳等;②AMA≥1∶40，尤其是AMAM2阳性，有胆汁淤积的生物化学改变(ALP和GGT升高且无其他原因)，B超检查胆道系统正常;③肝活组织检查符合PBC改变。符合上述三项可确诊为PBC，符合前两项者但未进行肝活组织检查视为可疑PBC。所有患者临床表现各异，肝功能指标中ALT、AST、GGT、ALP 及 TBA 均明显异常，均无其他肝脏相关疾病及自身免疫性疾病。

1.2 CD4+T细胞的分选和培养 收集患者外周肝素抗凝血15 ml，分离外周血单个核细胞(PBMC)。采用德国Miltenyi公司磁珠分选试剂盒分选CD4+T细胞，分选纯度大于97%。将分选的CD4+T细胞加入RPMI1640培养液，以细胞数为2×105L－1的细胞悬液加入到96孔 U型板中，在anti-CD3(1 μg/ml)和anti-CD28(1 μg/ml)的刺激条件下，加入不同浓度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)。于 37℃、5%CO2细胞培养箱中培养细胞，于不同时间收集细胞或上清进行下续实验。

1.3 CD69和CD25表达水平检测 分别于CD4+T细胞培养36 h及72 h后，收集细胞检测CD69及CD25分子表达。收集细胞，离心(1 500 r/min，5 min)，制成细胞悬液，加入抗人FITC-CD69抗体或抗人PE-CD25抗体表面染色，4℃避光孵育30 min，洗涤(1 500 r/min，5 min)染色细胞重悬，采用BD CantoⅡ流式细胞检测仪检测，FACS Diva6.0软件分析流式检测结果。流式抗体购自美国eBioscience公司。

1.4 CFSE标记CD4+T细胞 将分选的CD4+T细胞加入RPMI1640培养液，调整细胞数1×106/L－1，将CFSE加入细胞悬液中(终浓度5 μmol/L)，加入不同浓度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)，培养 7 d。培养第1天起在各孔均加入 anti-CD3(1 μg/ml)、anti-CD28(1 μg/ml)。于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行细胞培养，隔2 d换液，采用BD CantoⅡ流式细胞检测仪检测CD4+T细胞增殖情况。

1.5 IL-17和IFN-γ水平检测 收集细胞培养上清液，按北京达科为有限公司ELISA试剂盒说明书严格操作。

1.6 IL-17和IFN-γ胞内水平检测 将培养7 d后的细胞在刺激剂PMA、Inomycin与monensin刺激下继续培养4 h。收集上述培养后的细胞，离心(1 500 r/min，5 min)，制成细胞悬液，加入抗人PECY7-CD4抗体表面染色，4℃避光孵育30 min，洗涤(1 500 r/min，5 min)，固定破膜。加入抗人 FITC-IL-17、APCIFN-γ抗体胞内染色，4℃避光孵育30 min，离心洗涤(1 500 r/min，5 min)，cell staining buffer重悬，采用BD CantoⅡ流式细胞检测仪检测，FACS Diva6.0软件分析流式检测结果。流式抗体购自美国ebioscience公司。

2 结果

2.1 BF抑制PBC患者CD4+T细胞活化 PBC患者CD4+T细胞在anti-CD3和anti-CD28单抗的刺激条件下，加入不同浓度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)培养后，FCM检测早期活化抗原CD69和中期活化抗原CD25表达情况。结果表明(图1)，随着BF浓度的增加，CD69和CD25的表达率均相应地下降，尤其在100 μmol/L的BF干预浓度下，两者的表达抑制率均达到10%左右，进一步提示了BF呈浓度依赖性地部分抑制CD4+T细胞的早中期活化。

2.2 BF抑制PBC患者CD4+T细胞增殖 CFSE标记的PBC患者CD4+T细胞在anti-CD3和anti-CD28单抗的刺激条件下，加入不同浓度的BF(0、10、50、100 μmol/L)进行培养 7 d，FCM 检测CD4+T细胞增殖。结果表明(图2)，无BF干预时，CD4+T细胞增殖明显(7代)，其增殖率随着BF干预浓度增加而降低，50 μmol/L明显抑制CD4+T细胞增殖。

2.3 BF抑制PBC患者CD4+T细胞培养上清中IL-17和IFN-γ表达 ELISA法检测未处理组及BF处理组中IL-17和IFN-γ水平差异，显示BF处理组中IL-17和IFN-γ水平较未处理组明显降低(图3，P＜0.05)。

图1 BF抑制PBC患者CD4+T细胞CD69和CD25的表达Fig.1 Expression of CD69 and CD25 on CD4+T cells of PBC patients by bezafibrate suppressing

图2 BF抑制PBC患者CD4+T细胞增殖Fig.2 Inhibition efficiency of bezafibrate on CD4+T cells proliferation in PBC patients

图3 BF抑制PBC患者CD4+T细胞培养上清中IL-17和IFN-γ表达Fig.3 Expression of IL-17 and IFN-γ in CD4+T cells culture supernatants of PBC patients by BF suppressing

2.4 BF 抑制 PBC 患者 IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和IFN-γ－IL-17+CD4+T细胞各亚群细胞因子分泌 CD4+T细胞在anti-CD3和anti-CD28单抗刺激条件下，根据IFN-γ和IL-17的产生情况，可以将CD4+T细胞分为3个不同亚群，分别为IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和 IFN-γ－IL-17+细胞，而 BF 对各亚群细胞因子分泌都有不同程度的抑制，且呈浓度依赖性(图4，P ＜0.05)。

3 讨论

图4 BF抑制PBC患者CD4+T细胞各亚群细胞因子(IFN-γ+IL-17－/IFN-γ+IL-17+/IFN-γ－IL-17+)的分泌Fig.4 Flow cytometry analyzed CD4+T cells subgroup cytokine secretion in PBC patients by BF suppressing

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)除参与脂质和葡萄糖代谢外还可参与炎症反应，PPARs属于核受体，是一类配体激活的核转录因子，在特定配体激活下，可抑制多种炎症因子的表达。BF是非选择性的脂质PPARs激动剂，兼而具有激动PPARα、PPARδ、PPARγ的作用，其中以α亚型亲和力最高。近年国外临床实践发现BF对PBC患者也有一定临床疗效，对UDCA耐药的PBC患者单用或联合使用BF，可明显改善临床症状，可能是BF能通过PPARα增加多重耐药基因(MDR3)表达和诱导MDR3-P糖蛋白的表达，使磷脂分泌到胆汁，与疏水胆汁酸形成胶体对胆管上皮起保护作用，但其具体作用机理不明。故本文着重以PBC患者为研究对象，探讨BF治疗PBC的某些机制。

PBC是以肝内小胆管进行性、非化脓性炎症为特征的自身免疫疾病，其病因和确切发病机制至今尚不完全清楚，目前认为CD4+T细胞介导的自身免疫反应在PBC发病过程中发挥了重要作用。CD4+T细胞的异常活化和增殖在PBC发病过程中起关键作用。故而抑制其活化和增殖对于PBC的治疗具有重要意义。在T细胞的活化中，CD69不仅是它的早期活化标记分子，还可作为细胞的共刺激信号进一步加强细胞的增殖分化［4］;CD25作为T细胞中期活化分子，是IL-2受体(IL-2R)α链，可与IL-2Rβ链、IL-2Rγ链组成IL-2R，进一步与IL-2结合，诱导细胞的增殖分化［5］。CD69和CD25作为T细胞不同时期的活化标记，可反映T细胞的活化水平，两者在BF的干预下均出现表达的下调，从而表明BF可抑制CD4+T细胞的活化。而T细胞活化是早期免疫应答的重要表现，选择性阻断T细胞异常活化可进一步抑制T细胞的增殖分化，阻止其介导的自身免疫反应，因此，本研究还采用活体染料CFSE标记追踪PBC患者CD4+T细胞增殖，显示BF对PBC患者外周血分离的经抗CD3/CD28刺激的CD4+T细胞的增殖具有抑制作用，提示BF可通过抑制CD4+T细胞的活化增殖来抑制PBC患者体内异常的免疫反应。

CD4+T细胞根据其产生的细胞因子不同而分为不同的亚群，分别为Th1、Th2及Th17。Th1细胞产生IFN-γ，参与细胞介导的免疫反应;Th2细胞产生IL-4，参与体液介导的免疫反应;Th17细胞产生IL-17，在防御胞外菌感染、介导慢性炎症以及自身免疫病中发挥重要作用［6-11］。目前已发现许多Th1与Th17细胞因子的表达水平与PBC患者的发生发展密切相关。文献报道，活动性PBC患者外周血Th细胞表达IFN-γ和/或IL-17的水平明显升高。而来自临床试验及动物实验的结果也显示，IFN-γ和/或IL-17在PBC致病机制中发挥了重要的作用［12］。而Th17细胞又可进一步分为表达IL-17+IFN-γ+和IL-17+IFN-γ－两类细胞群，表达 IL-17+IFN-γ+的Th17/Th1细胞在近年研究中也备受关注。已在小鼠模型的实验中发现Th17/Th1比只分泌IL-17的Th17细胞更具致病性［13］。而在PBC患者中这两类细胞群谁起最主要的致病作用，还是都起作用还需进一步的证明。ELISA结果发现BF呈浓度依赖抑制PBC患者外周血CD4+T细胞IL-17和IFN-γ的分泌，进一步流式结果显示BF抑制CD4+T细胞中IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和 IFN-γ－IL-17+各亚群细胞的分化，提示BF抑制Th1及Th17细胞分化和其细胞因子释放，可能有助于缓解PBC急性期及慢性期过度的系统性炎症反应。然而BF抑制IFN-γ在50 μmol/L与100 μmol/L浓度差异有显著性，而对IL-17抑制50 μmol/L与100 μmol/L浓度差异无显著性，提示BF可能是通过不同的作用途径影响CD4+T细胞分化与细胞因子分泌。

总之，本研究从活化增殖、细胞因子分泌和细胞分化等多方面检测了BF对PBC患者CD4+T细胞的干预作用，显示BF可通过抑制CD4+T细胞活化增殖、细胞因子的分泌及Th1、Th17细胞分化发挥免疫抑制作用。为临床上应用BF治疗PBC提供新的理论依据。

［1］张文忠，姚 萍.原发性胆汁性肝硬化发病的分子机制研究进展［J］.重庆医学，2009，38(21):2740-2742.

［2］Hazzan R，Tur-Kaspa R.Bezafibrate treatment of primary biliary cirrhosis following incomplete response to ursodeoxycholic acid［J］.J Clin Gastroenterol，2010，44(5):371-373.

［3］Takeuchi Y，Ikeda F，Fujioka S，et al.Additive improvement induced by bezafibrate in patients with primary biliary cirrhosis showing refractory response to ursodeoxycholic acid［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26(9):1395-1401.

［4］Testi R，D＇Ambrosio D，De Maria R，et al.The CD69 receptor:a multipurpose cell-surface trigger for hematopoietic cells［J］.Immunol Today，1994，15(10):479-483.

［5］Gonzalez-Garcia A，Merida I，Martinez-AC，et al.，Intermediate affinity interleukin-2 receptor mediates survival via a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway［J］.J Biol Chem，1997，272(15):10220-10226.

［6］Li X，Yuan FL，Lu WG，et al.The role of interleukin-17 in mediating joint destruction in rheumatoid arthritis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，397(2):131-135.

［7］Kohno M，Tsutsumi A，Matsui H，et al.Interleukin-17 gene expression in patients with rheumatoid arthritis［J］.Mod Rheumatol，2008，18(1):15-22.

［8］Pernis AB.Th17 cells in rheumatoid arthritis and systemic lupus drythematosus［J］.J Intern Med，2009，265(5):644-652.

［9］Murata M，Fujimoto M，Matsushita T，et al.Clinical association of serum interleukin-17 levels in systemic sclerosis:is systemic sclerosis a Th17 disease［J］.J Dermatol Sci，2008，50(3):240-242.

［10］Kunz M，Ibrahim.Cytokines and cytokines profiles in human autoimmune diseases and animal models of autoimmunity［J］.Mediators Inflamm，2009，2009:979258.

［11］Chen XQ，Yu YC，Deng HH，et al.Plasma IL-17A is increased in new-onset SLE patients and associated with disease activity［J］.J Clin Immunol，2010，30(2):221-225.

［12］邓日辉，陈 颖，陈曲波.IL-1β、IL-6和IL-23对原发性胆汁性肝硬化患者Th17细胞形成的影响［J］.中国免疫学杂志，2010，26(5):449-452.

［13］Bending D，De La Pena H，Veldhoen M，et al.Highly purified Th17 cells from BDC2.5NOD mice convert into Th1-like cells in NOD/SCID recipient mice［J］.J Clin Invest，2009，119(3):565-572.