甲状腺乳头状癌患者血清、癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 的表达及临床意义①

孙勤暖 李冬梅 吴 罡 屠 军 云 芬 徐晓艳 于慧玲

(内蒙古医科大学病理教研室，呼和浩特 010059)

甲状腺肿瘤是人类头颈部疾病中的常见病和多发病，而甲状腺乳头状腺癌是甲状腺肿瘤中最常见的恶性肿瘤，约占甲状腺癌的60%～70%，但我们对其发生发展的机制知之甚少［1］。肿瘤的发生发展是一个多因素的生物学行为，其发生发展可能与众多癌基因、抑癌基因有关，因此探索不同基因在甲状腺乳头状癌中的表达情况，有助于我们更好地了解其发生机制及指导临床治疗［2］。目前国内外对甲状腺乳头状癌的研究在逐渐地深入，但对其发生机制尚不清楚，因此找到甲状腺乳头状癌发生发展的分子标记物，是早期诊断甲状腺乳头状癌的关键。本研究采用酶联免疫学分析、免疫组织化学技术及分子生物学技术联合检测凋亡因子:p53、Fas、TNFα 和Cyclin E 在甲状腺乳头状癌中的表达，探讨p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 能否成为甲状腺乳头状癌发生发展的分子标记物，以利于提高甲状腺乳头状癌早期诊断率，同时探讨其与甲状腺乳头状癌的发生发展、转移关系，为指导甲状腺癌临床诊断及判断预后提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料 随机选择内蒙古医科大学附属医院2012 年4 月至2013 年8 月，经穿刺确诊为甲状腺乳头状癌的住院患者74 例作为实验组［癌组织74 例及对应的癌旁组织74 例，男29 例、女45 例，平均年龄(40.3±3.6)岁］、同期体检健康人26 例作为正常对照组［男12 例、女14 例，平均年龄(37.9±2.4)岁］。癌症患者全部排除其他器官瘤变，具有可比性。

1.2 实验试剂和主要仪器 兔抗人p53、Fas、TNFα 和Cyclin E 多克隆抗体均购于Santa Cruz 公司;SP 免疫组织化学试剂盒和DAB 显色试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司;p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E ELISA 试剂盒购于南京建成生物有限公司;Trizol、引物、反转录试剂盒及实时荧光定量PCR 试剂盒均购于北京鼎国生物有限公司。Leica RM 2245石蜡切片机(德国)、Leica HI1210 捞片机(德国)、LEICA HI1220 摊片机(德国);LEICA EG1150 包埋机(德国);Biotek Epoch 酶标仪(美国);实时荧光定量PCR 仪(型号ABI7300，美国);Biometra PCR 扩增仪(美国);OLYMPUS BX51(日本)。

1.3 检测指标

1.3.1 血清、癌旁正常组织和癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白含量的测定 采用ELISA 方法检测，严格按照试剂盒操作。

1.3.2 癌旁正常组织和癌组织中p53、Fas、TNF-α和Cyclin E 蛋白阳性强度的测定 采用免疫组织化学方法，常规石蜡切片，4 μm，操作步骤严格按照说明书进行，DAB 显色后，用苏木精复染，封片。光镜下观察见棕黄色为阳性表达，结果分析采用Motic Images Advanced 3.2 图像分析系统测灰度值，灰度值越低，蛋白含量越高。

1.3.3 癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白阳性率的测定 分析p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 的表达与甲状腺乳头状癌的临床分期、病理类型及有无淋巴结转移的关系。在200 倍镜下观察全片，按阳性细胞所占百分比及着色程度进行结果判定［3］。按阳性细胞比例判定:阳性细胞＜10% 计1 分，10%～50%计2 分，＞50%计3 分。按染色程度判定:阴性为0 分，淡黄色为1 分，中度黄色2 分，棕黄色3 分。按(阳性细胞得分×染色程度)得分计总分，总分＜3 分为阴性，≥3 分为阳性。

1.3.4 癌旁正常组织和癌组织中p53、Fas、TNF-α和Cyclin E 的基因表达的检测 引物序列由北京鼎国生物有限公司合成。P53:Sense:5'-GAAGCAGTAAGTCAGGAGGGTT-3'，Antisense:5'-GGAAGGTTCTAGGCTGGAGG-3'，产物254 bp;FAS:Sense:5'-TGTGATGAAGGGCATGGTTT-3'，Antisense:5'-TTGGTGTTGCTGGTTCGTG-3'，产 物 176 bp;TNF-α:Sense:5'-GGTGATCGGTGCCAACAAGGA-3'，Antisense:5'-CACGCTGGCTCAGCCACTG-3'，产物173 bp;Cyclin E:Sense:5'-CCACCTCCATCACCACTACCA-3'，Antisense:5' -CCATTCCAACCAGAGCCACC-3'，产物136 bp。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0 软件进行统计学分析，血清、癌旁正常组织和癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 的检测结果均以±s 表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 血清、癌旁正常组织和癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白含量的比较 术前，实验组患者血清中p53、Fas 和TNF-α 的蛋白含量明显低于正常对照组，Cyclin E 的蛋白含量明显高于正常对照组，差异均有统计学意义(P ＜0.01);术后，实验组患者血清中p53、Fas 和TNF-α 的蛋白含量低于正常对照组，Cyclin E 的蛋白含量高于正常对照组，差异亦均有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。实验组患者癌组织中p53、Fas 和TNF-α 的蛋白含量明显低于癌旁正常组织，Cyclin E 的蛋白含量明显高于癌旁正常组织，差异亦均有统计学意义(P ＜0.05)，见表2。

2.2 癌旁正常组织和癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白阳性强度的比较 光学显微镜观察:免疫组织化学染色阳性部位为细胞质染为棕黄色，细胞核用苏木精复染为蓝色。实验组患者癌组织中p53、Fas 和TNF-α 的蛋白阳性表达强度明显低于癌旁正常组织，Cyclin E 的蛋白阳性表达强度明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义(P ＜0.05)，见表3 及图1、2。

2.3 癌旁正常组织和癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 基因水平的比较 实验组患者癌组织中p53、Fas 和TNF-α 的基因水平明显低于癌旁正常组织，Cyclin E 的基因水平明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义(P ＜0.05)，见表4。

表1 手术前后两组血清中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白含量的比较(±s)Tab.1 Comparison of two groups p53，Fas，TNF-α and Cyclin E protein content in serum before and after operation(±s)

表1 手术前后两组血清中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白含量的比较(±s)Tab.1 Comparison of two groups p53，Fas，TNF-α and Cyclin E protein content in serum before and after operation(±s)

Note:1)P ＜0.01，2)P ＜0.05 compared with normal control group;3)P ＜0.01 compared with before.

表2 癌旁正常组织、癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E蛋白含量的比较(±s)Tab.2 Comparison of p53，Fas，TNF-α and Cyclin E protein content in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

表2 癌旁正常组织、癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E蛋白含量的比较(±s)Tab.2 Comparison of p53，Fas，TNF-α and Cyclin E protein content in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

Note:1)P ＜0.01 compared with normal para cancer tissue.

表3 癌旁正常组织、癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E蛋白阳性强度的比较(±s)Tab.3 Comparison of p53，Fas，TNF-α and Cyclin E protein positive strength in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

表3 癌旁正常组织、癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E蛋白阳性强度的比较(±s)Tab.3 Comparison of p53，Fas，TNF-α and Cyclin E protein positive strength in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

Note:1)P ＜0.01 compared with normal para cancer tissue.

图1 p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 在甲状腺乳头状癌组织中的表达(免疫组织化学染色，×200)Fig.1 Expression of p53，Fas，TNF-α and Cyclin E in thyroid papillary carcinoma (immunohistochemical staining，×200)

图2 p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 在癌旁正常组织中的表达(免疫组织化学染色，×200)Fig.2 Expression of p53，Fas，TNF-α and CyclinE in normal tissues adjacent to cancer (immunohistochemical staining，×200)

表4 癌旁正常组织、癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E基因水平的比较Tab.4 Comparison of v53，Fas，TNF-α and Cyclin E gene level in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

表4 癌旁正常组织、癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E基因水平的比较Tab.4 Comparison of v53，Fas，TNF-α and Cyclin E gene level in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

Note:1)P ＜0.01 compared with normal para cancer tissue.

2.4 癌组织中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白阳性率与临床病理特征关系的测定 p53、Fas、TNF-α和Cyclin E 蛋白阳性表达率与甲状腺乳头状癌临床分期、病理类型和有无淋巴结转移均有明显相关性(P ＜0.01);p53、Fas、TNF-α 均随着病变的加重表达减少，而Cyclin E 随着病变的加重表达增多，见表5。

表5 p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 的表达与甲状腺乳头状癌临床特征的关系Tab.5 Relationship between clinical features and expression of thyroid papillary carcinoma p53，Fas，TNF-α and Cyclin E

3 讨论

甲状腺癌是近20 年发病率增长最快的实体恶性肿瘤，年均增长6.2%［4］。大多数甲状腺肿瘤应用组织病理学和细胞学检查能做出诊断，但有些甲状腺肿瘤的良恶性不易区分，用常规检查难以做出明确分类，此时需应用一些新技术(如免疫组织化学、细胞和分子遗传学技术)辅助诊断，区分肿瘤不同的生物学行为，以避免过度治疗和保证及时有效治疗［5］。细胞凋亡又称程序性死亡，是在某些生理和病理条件下，细胞主动参与自身有一定程序的死亡过程，近年来细胞凋亡与肿瘤的关系日益密切，从基因学角度探讨肿瘤发生发展、浸润、转移的机制已经成为研究热点［6，7］。

已有研究证实，细胞凋亡及其调控基因异常是肿瘤发生的重要机制之一［8，9］，多种基因参与细胞凋亡的调控，其中包括p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E等基因，凋亡不仅存在于正常组织，也存在于肿瘤组织，因此在肿瘤的发生发展及治疗中起着重要作用。Fas 抗原是人体多种细胞表面的一种膜蛋白，是一种触发凋亡的蛋白质，它属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族;当它与Fas 配体或抗Fas 抗体结合时诱导凋亡［10］。TNF-α 是一个多效性的细胞因子，由巨噬细胞产生，广泛参与细胞反应，包括发热、休克、组织损伤以及肿瘤坏死等效应，并诱导其他细胞因子、免疫调节因子参与细胞增生、分化与凋亡。TNF-α 与癌细胞表面受体结合成复合物进入细胞并与溶酶体融合，在TNF-α 的作用下溶酶体裂解释放蛋白酶类导致细胞自溶［11，12］。Cyclin E 是一种核蛋白，Cyclin E 的表达受细胞周期调节，并在G1 期末达到高峰。Cyclin E 在许多人类肿瘤中存在高表达，它能特异性地与细胞周期依赖激酶(CDK2)结合形成Cyclin E/CDK2 复合物，可以使底物磷酸化，释放转录因子，使细胞通过起始点进入S 期。在异常情况下，Cyclin E 过度表达存在于整个细胞周期中并持续地激活CDK2，底物磷酸化持续进行［13，14］。p53 基因作为肿瘤抑制基因已被人们熟知，它分为两型:一型是使细胞周期停止在G1 期，抑制细胞繁殖的野生型;一型是具有突变能力的变异型［15］。野生型p53 可诱导易感细胞发生凋亡、捕获G1 周期，引起p53 激活与DNA 修复有关或凋亡的相关基因如TNF-α 和Fas，大量资料表明p53 因阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而达到抗癌作用;而变异型p53基因则无此功能，因此缺失p53 诱导的凋亡可能是转化为肿瘤的重要因素之一［16］。

综上所述，本实验研究结果表明:甲状腺乳头状癌的发生发展与p53、Fas、TNF-α 基因的下调和Cyclin E 基因的上调密切相关，p53 的缺失进一步诱导了Fas、TNF-α 的低表达和Cyclin E 的高表达，继而促进细胞异常增殖、肿瘤形成。四种蛋白的阳性表达率与甲状腺乳头状癌临床分期、病理类型和有无淋巴结转移均有明显相关性，提示p53、Fas、TNF-α和Cyclin E 可能在甲状腺乳头状癌浸润和转移中起重要作用，四者的联合检测可成为判断预后和指导临床用药的指标。

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