冠心舒通对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及脑组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响①

2014-11-27李冬梅马洪喜长春大学特殊教育学院长春130022

中国免疫学杂志 2014年6期

汪伟李冬梅马洪喜(长春大学特殊教育学院，长春 130022)

脑血管病是临床常见病、多发病，其发病率、病死率逐年升高，在这一疾病相应的治疗过程中发现脑缺血再灌注(Cerebral ischemia-reperfusion，I/R)的病理生理过程起着重要的作用［1］。近年来研究发现脑I/R损伤与细胞凋亡有着密切的关系，凋亡机制参与脑I/R损伤已成为临床研究的热点［2］。以往研究表明，冠心舒通具有调整、改善心血管功能的作用，它能减轻心肌缺血程度及减小梗塞面积、能降低血浆纤维蛋白原含量、抑制血小板黏附性和聚集性、改善血液流变性、增加冠脉血流量及改善心肌的供血供氧，对心肌缺血再灌注损伤有明确的保护作用［3-5］，但对冠心舒通能否影响脑I/R损伤的研究甚少，本实验通过检测大鼠学习记忆能力及细胞凋亡的调控，旨在探究冠心舒通是否对脑I/R损伤具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂冠心舒通胶囊(咸阳步长制药有限公司生产，每粒装0.3 g，国药准字Z20020055，产品批号100101);兔抗鼠Bcl-2和Bax抗体购于北京博奥森生物有限公司;SP和DAB试剂盒购于福州迈新生物有限公司;ELISA试剂盒购于南京建成生物有限公司。

1.2 模型的制作采用线栓法，结扎大鼠左侧颈总动脉建立脑I/R模型。选长约5 cm、直径0.24 mm的美国进口尼龙实验栓线。用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉满意后四肢及头部固定，颈部正中做2 cm竖切口，先分离左侧颈总动脉，再分离左颈内动脉及颈外动脉，避免刺激迷走神经，沿颈内动脉向上走行分离翼腭动脉，结扎根部。假手术组仅暴露颈总动脉其他不作处理。造模成功标准清醒后评定:(1)右侧前肢屈曲，不能完全伸展;(2)提尾时，右侧前肢抓力减弱;(3)提尾时向右侧转圈;(4)自由运动时，无方向性，向右侧转圈或倾倒;(5)不能自发行走，意识丧失。造模成功后2 h将栓线拔出形成再灌注模型。

1.3 动物分组及给药健康的Wistar大鼠60只(吉林大学白求恩医学部动物实验中心提供，动物许可证号:SCXK2007-吉大-0003)。体重(210±20)g，每组15只，随机分为假手术组、脑I/R模型组、冠心舒通组;冠心舒通组依据大鼠长期毒性试验分为:高剂量(1 g/kg)组和低剂量(0.5 g/kg)组，冠心舒通将其研磨制成悬浊液。造模前每组分别每日灌胃给予生理盐水、生理盐水、冠心舒通高剂量和冠心舒通低剂量，连续7 d;缺血120 min后松扎，伤口撒头孢唑啉钠粉末0.25 g后逐层缝合，放回笼中饲养;假手术组仅分离颈总动脉，不做任何处理;术后每天上午灌胃给予生理盐水、生理盐水、冠心舒通高剂量和冠心舒通低剂量，3 d后水迷宫训练同时继续给药，连续7 d。

1.4 动物检测选取实验结束后，去除死亡的和状态极差的大鼠，每组各取10只检测。

1.5 检测指标

1.5.1 Morris水迷宫测试测试潜伏期、经过平台次数和平台象限停留时间，Morris水迷宫训练7 d后，于第8天测试。

1.5.2 大鼠血清中Bcl-2和Bax蛋白水平的检测采用ELISA法检测，严格按试剂盒说明书操作。

1.5.3 大鼠脑组织的病理改变采用HE染色观察，常规石蜡包埋，切片5 μm，光学显微镜下观察。

1.5.4 大鼠脑组织中Bcl-2和Bax蛋白水平的检测

采用免疫组织化学-SP法检测，切片3 μm，严格按试剂盒说明书进行。光学显微镜下观察结果:细胞质阳性呈棕黄色，苏木精复染细胞核呈蓝色。

1.5.5 大鼠脑组织中Bcl-2和Bax mRNA水平的检测引物序列由上海生物工程公司合成。Bcl-2;上游引物5'-CACATCTGGAGACTATAAGA-3'，下游引物5'-CTCTAAGTTGCGTTATCTAC-3'，产物242 bp;Bax:上游引物5'-GCTAATGGAGGAGAAGAAGT-3'，下游引物 5'-CTGACCTGTTGGACCTTGTG-3'，产物298 bp;凝胶成像后用凝胶图像分析系统分析结果。

1.6 统计学处理采用SPSS13.0统计学分析软件，测试潜伏期、经过平台次数、平台象限停留时间、大鼠血清中Bcl-2及Bax的蛋白水平和脑组织中Bcl-2、Bax的蛋白及mRNA水平，其数据均以表示，进行t检验。

2 结果

2.1 测试潜伏期、经过平台次数和平台象限停留时间的检测与脑I/R模型组比较，冠心舒通高剂量和低剂量组大鼠测试潜伏期均缩短、经过平台次数均增多、平台象限停留时间均增加，差异均有统计学意义(P＜0.01)，且冠心舒通高剂量组好于冠心舒通低剂量组，有显著差异(P＜0.01);与假手术组比较，冠心舒通高剂量组大鼠测试潜伏期略延长、经过平台次数和平台象限停留时间略减少，但无显著差异(P＞0.05)，冠心舒通低剂量组大鼠测试潜伏期延长、经过平台次数和平台象限停留时间减少，有显著差异(P＜0.01)，脑I/R模型组大鼠测试潜伏期明显延长、经过平台次数和平台象限停留时间明显减少，有显著差异(P＜0.01);见表1。

表1 各组大鼠测试潜伏期、经过平台次数和平台象限停留时间的比较(，n=15)Tab.1 Comparision of escape latency ，times to cross target area and average time spent in platform quadrant in different groups(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Escape latency(s) Times to cross target area Average time spent in platform quadrant(s)Sham-operated group 31.47±3.61 2.76±0.38 21.45±3.16 Model group 56.39±4.031) 0.93±0.121) 8.14±1.011)High-dose group 36.42±2.962) 2.61±0.332) 20.66±3.522)Low-dose group 43.18±3.273) 1.82±0.573) 15.26±1.933)

2.2 脑组织的病理改变结果 HE染色结果假手术组:脑组织细胞排列紧密整齐;模型组:脑组织细胞排列松散紊乱，细胞核浓缩，细胞质淡染;高剂量组:脑组织细胞排列比较紧密整齐;低剂量组:脑组织细胞排列较为紧密整齐，可见细胞核浓缩，细胞质淡染;见图1。

图1 脑组织的病理改变(HE染色，×200)Fig.1 Pathological changes in brain tissue(HE staining ，×200)

2.3 大鼠血清中Bcl-2和Bax蛋白的水平与脑I/R模型组比较，冠心舒通高剂量和低剂量组血清中Bax蛋白含量降低、Bcl-2蛋白含量升高均有统计学意义(P＜0.01)，且冠心舒通高剂量组好于冠心舒通低剂量组，有显著差异(P＜0.01);与假手术组比较，冠心舒通高剂量组大鼠血清中Bax蛋白含量略升高、Bcl-2蛋白含量略降低，但无显著差异(P＞0.05)，冠心舒通低剂量组大鼠血清中Bax蛋白含量升高、Bcl-2蛋白含量降低，有显著差异(P＜0.01)，脑I/R模型组大鼠血清中Bax蛋白含量明显升高、Bcl-2蛋白含量明显降低，有显著差异(P＜0.01);见表2。

2.4 大鼠脑组织中Bcl-2和Bax蛋白表达的水平与脑I/R模型组比较，冠心舒通高剂量和低剂量组大鼠脑组织中Bax蛋白含量降低、Bcl-2蛋白含量升高均有统计学意义(P＜0.01)，且冠心舒通高剂量组好于冠心舒通低剂量组有显著差异(P＜0.01);与假手术组比较，冠心舒通高剂量组大鼠脑组织中Bax蛋白含量略升高、Bcl-2蛋白含量略降低但无显著差异(P＞0.05)，冠心舒通低剂量组大鼠脑组织中Bax蛋白含量升高、Bcl-2蛋白含量降低有显著差异(P＜0.01)，脑I/R大鼠脑组织中Bax蛋白含量明显升高、Bcl-2蛋白含量明显降低有显著差异(P＜0.01);采用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统，灰度值越高阳性表达越低，灰度值越低阳性表达越高。见表2，图2～4。

2.5 大鼠脑组织中Bcl-2和Bax mRNA的水平凝胶成像后用凝胶图像分析仪分析结果，与脑I/R模型组比较，冠心舒通高剂量和低剂量组大鼠脑组织中Bax mRNA水平降低、Bcl-2 mRNA水平升高均有统计学意义(P＜0.01)，且冠心舒通高剂量组好于冠心舒通低剂量组有显著差异(P＜0.01);与假手术组比较，冠心舒通高剂量组大鼠脑组织中Bax mRNA水平略升高、Bcl-2 mRNA水平略降低但无显著差异(P＞0.05)，冠心舒通低剂量组大鼠脑组织中 Bax mRNA水平升高、Bcl-2 mRNA水平降低，有显著差异(P＜0.01)，脑 I/R模型组大鼠脑组织中 Bax mRNA水平明显升高、Bcl-2 mRNA水平明显降低有显著差异(P＜0.01)。见表3。

表2 各组大鼠血清、脑组织中Bcl-2和Bax蛋白的比较(，n=15)Tab.2 Comparision of Bcl-2 and Bax protein expression in rat serum and brain tissues(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Serum(pg/ml)Brain tissue(gray value)Bcl-2 Bax Sham-operated group 7.45±1.03 5.27±1.14 100 Bcl-2 Bax.21±3.56 132.82±3.49 Model group 2.61±0.521) 10.16±1.351) 160.58±4.131) 82.12±2.061)High-dose group 7.09±1.122) 5.61±0.982) 110.65±2.712) 126.31±2.922)Low-dose group 5.03±0.763) 8.11±0.973) 136.72±3.463) 100.49±2.683)

图2 脑组织中Bcl-2的表达(免疫组织化学染色，×200)Fig.2 Bcl-2 expression in brain tissue(Immunohistochemical staining ，×200)

图3 脑组织中Bax的表达(免疫组织化学染色，×200)Fig.3 Bax expression in brain tissue(Immunohistochemical staining ，×200)

图4 脑组织中Bcl-2和Bax蛋白的水平Fig.4 Protein levels of Bcl-2 and Bax in brain tissue

3 讨论

近年来随着脑血管病发病率的逐年上升，脑血管病成为临床常见的三大致死疾病之一［6］，脑血管病尤其是缺血后再灌注损伤对脑的影响成为国内学者研究缺血性脑损伤的热点。众多的研究［7］表明脑缺血再灌注损伤过程中细胞凋亡发挥重要作用，机体的细胞凋亡过程中有多种蛋白参与调控，其中Bcl-2蛋白家族是人们研究最多的一类凋亡蛋白［8］，Bcl-2蛋白家族分布在线粒体外膜等处，分为两大类:促凋亡类，如 Bid、Bax、Bak等，也就是 Bax能促进细胞凋亡;抑凋亡类，如Bcl-2、Bcl-X1等，也就是Bcl-2能抑制细胞凋亡;这两类蛋白可通过形成异二聚体发挥相互拮抗或放大作用，因此研究Bcl-2和Bax的表达趋势是决定细胞凋亡与否的主要因素。

表3 各组大鼠脑组织中Bcl-2和Bax的mRNA的比较(，n=15)Tab.3 Bcl-2 and Bax mRNA expression in brain tissue in different groups(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Bcl-2 Bax Sham-operated group 1.25±0.13 0.86±0.06 Model group 0.41±0.051) 1.92±0.241)High-dose group 1.18±0.092) 0.91±0.032)Low-dose group 0.83±0.113) 1.44±0.173)

冠心舒通胶囊由广枣、丹参、丁香、冰片、天竺黄等组成［9］，其中广枣的有效药理成分为广枣总黄酮，动物实验表明能显著延长小鼠的耗氧速度、提高小鼠耐缺氧的能力、显著延长小鼠痛觉反应潜伏期(热板法)或显著减少醋酸刺激引起的扭体反应次数［10］;天竺黄对离体兔耳血管有直接扩张作用，小鼠实验有显著抑制毛细血管通透性作用［10］;丹参的有效成分是丹参酮临床试验结果表明能改善冠心病、心绞痛和胸闷等症状［12］，且以往的研究［13-15］表明:广枣能抑制心肌细胞凋亡诱导肿瘤细胞凋亡;丹参抗神经元细胞及血管内皮细胞凋亡且能促进肿瘤细胞凋亡;丁香、冰片及天竺亦具有抗海马神经元凋亡和促进肿瘤细胞凋亡的作用，其根本在于这5种有效成分能通过阻止线粒体膜电位的下降和线粒体膜通透性转换孔的开放，抑制线粒体促凋亡的蛋白质如细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)等的释放，从而防止细胞凋亡发生。因此本实验复制大鼠脑I/R损伤模型，给予高、低剂量的冠心舒通后检测大鼠学习记忆能力及脑组织Bcl-2和Bax的蛋白及mRNA的表达水平，实验结果表明冠心舒通高剂量和低剂量组大鼠测试潜伏期均缩短、经过平台次数均增多、平台象限停留时间均增加(P＜0.01)，且冠心舒通高剂量组好于冠心舒通低剂量组有显著差异(P＜0.01);冠心舒通高剂量组血清和脑组织中Bax蛋白含量及 mRNA水平略升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平略降低但无显著差异(P＞0.05)，低剂量组大鼠血清和脑组织中Bax蛋白含量及mRNA水平升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平降低有显著差异(P＜0.01)，脑I/R模型组大鼠血清和脑组织中Bax蛋白含量及mRNA水平明显升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平明显降低有显著差异(P＜0.01)，提示冠心舒通能提高脑I/R损伤大鼠的学习记忆能力;能下调Bax蛋白、上调Bcl-2蛋白的水平对脑I/R损伤大鼠的脑组织具有保护作用;并证实冠心舒通高剂量组好于低剂量组，这是冠心舒通治疗缺血性脑血管病作用机制之一，其他机制有待于进一步的研究。

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