B7-H4在实验性自身免疫性心肌炎小鼠中的表达①

刘忠梁 李 戈 宋燕燕 崔 彬 苑海涛

(山东大学附属省立医院心内科，济南 250021)

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VCM)是危害人类特别是青少年的常见心脏病之一，是40岁前成人猝死的主要原因。部分VCM患者可转化为扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy，DCM)，导致心室扩大及心功能进行性恶化，已成为危害人类健康的常见心脏疾病。有研究显示，病毒感染后诱发的自身免疫损伤在VCM的发生发展及向DCM转化的过程中起重要作用［1］。实验性自身免疫性心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis，EAM)是一种由心肌肌凝蛋白诱导产生的自身免疫性疾病模型，其发病机制和病理特征与人类VMC和DCM相似，常作为研究心肌炎的动物模型［2］。B7-H4是B7家族的新成员［3］，参与调解T-B细胞相互作用而下调B细胞产生抗体，并参与调节效应T细胞的功能及维持外周耐受。已有文献报道，在狼疮肾炎［4］、类风湿关节炎［5，6］等自身免疫性疾病中，病变组织中有B7-H4蛋白的出现，提示B7-H4可能参与了这些疾病的发病过程。本实验拟通过建立EAM模型，用免疫组织化学染色、ELISA、Real-time PCR(Realtime PCR)等方法，观察B7-H4在心肌炎病程中表达的变化情况，以期为心肌炎的发病机制提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料 猪心肌肌凝蛋白、完全弗氏佐剂、刀豆蛋白A(Con A)均购自美国Sigma公司;Anti-B7-H4抗体购自 abcam公司;逆转录试剂盒购自美国Applied Biosystems公司;Real-time PCR试剂盒购自美国Agilent Technologies公司;引物由日本TaKaRa公司设计合成。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 4周龄雄性BALB/c小鼠72只，平均体重13～16 g，纯种近交系，购自山东大学医学院实验动物中心。实验动物随机分为对照组(24只)和实验组(48只)。

1.2.2 动物模型的制备及标本采集 将猪心肌肌凝蛋白(蛋白浓度1 mg/ml)与等体积完全弗氏佐剂混合。于实验第1、7、30天对实验组小鼠进行猪心肌肌凝蛋白400 μl(含蛋白质200 μl)注射，同时给予对照组同体积不含猪肌凝蛋白的完全弗氏佐剂及生理盐水。于实验第14、21、30、45天分批处死小鼠，血液离心后收集血清进行ELISA检测抗体滴度，无菌取脾脏进行淋巴细胞增殖实验，心肌一部分用甲醛固定，进行病理组织检测，另一部分冻存于－80℃冰箱中，之后进行实时荧光定量PCR。

1.2.3 病理组织检测 甲醛固定的心肌常规脱水、包埋并切片。部分切片行HE常规染色，光镜下观察心肌组织的炎症改变，另一部分按免疫组化试剂盒操作步骤进行免疫组织化学染色。所需图片均采用Leica相机及相应套件拍照摄取。

1.2.4 ELISA法检测血清抗心肌肌凝蛋白抗体用10 μg/ml猪心肌肌凝蛋白包被96孔板，4℃过夜，用含2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭未结合位点，小鼠血清1∶50起系列倍比稀释，室温孵育1 h，同时设空白孔。二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG，室温下孵育1 h，加入底物p-NPP，30 min后加入1 mol/L NaOH终止反应，在酶标仪405 nm处读取OD值。

1.2.5 脾脏淋巴细胞增殖实验 处死小鼠后，无菌取脾脏，已以200目铜网研磨脾脏获得单细胞悬浮液。用小鼠淋巴细胞分离液分离获得淋巴细胞，PBS冲洗2遍。将获得的淋巴细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI1640中，将细胞浓度调至3×105个/ml。将细胞液加入96孔板中，每孔100 μl。分别加入ConA(终浓度5 μg/ml)、猪心肌肌凝蛋白(终浓度50 μg/ml)或无任何抗原，每个指标设三个复孔。于37℃、5%CO2培养68 h，用cck-8法检测各孔的OD值。

1.2.6 Real-time PCR检测心肌中B7-H4的表达情况 将冻存于－80℃冰箱中心肌在液氮中粉碎，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，用紫外线分光光度计测定所提取RNA的浓度。按照反转录试剂盒配置反转录反应体系，逆转录生成cDNA。以βactin为内参，对cDNA中的B7-H4进行扩增。引物序列:β-actin上游引物:5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物:5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3';B7-H4上游引物:5'-GATGACGATGCCGTTGAGTTTG-3'，下游引物:5'-GATGACGATGCCGTTGAGTTTG-3'。PCR扩增条件为95℃预变性10 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，共 40 个循环。采用相对定量法，检测各组上述基因的 mRNA表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计学软件，数据均以χ2表示，多组均数之间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠心肌HE染色 小鼠心肌HE染色结果如图1所示。初次免疫后14 d，小鼠心脏即出现炎症表现，表现为心肌细胞间出现炎细胞浸润，尤其是小血管周围。初次免疫后第21天，心肌炎症加重，心肌组织及间质组织出现显著的炎细胞浸润并伴有局灶性坏死区。初次免疫后第30天，心肌炎症仍可见明显炎细胞浸润，但是较第21天时已减轻。初次免疫后第45天，仍可见心肌炎症表现，但是炎症程度已大为减轻。

2.2 小鼠心肌组织免疫组织化学染色 小鼠心肌组织免疫组织化学染色结果如图2所示。小鼠心肌免疫组化染色阳性表现为细胞核或者细胞浆出现棕黄色颗粒。实验结果显示，在各个时间点心肌炎小鼠心脏均有B7-H4阳性染色出现，染色部位为心肌血管内皮细胞，在周围心肌组织及正常心肌血管则无阳性表现。且各个时间点的阳性染色强度无明显差异。

2.3 心肌肌凝蛋白自身抗体检测 心肌肌凝蛋白自身抗体检测结果如图3所示。对照组小鼠血清中的心肌肌凝蛋白抗体滴度在不同时间点无明显差异(P＞0.05)。实验组小鼠血清中的心肌肌凝蛋白自身抗体滴度在第21及30天时抗体滴度最高，第45天时已显著降低，但较对照组均升高，差异有统计学差异(P＜0.05)。

2.4 脾脏淋巴细胞增殖实验 脾脏淋巴细胞增殖实验结果如图4所示。不同时间点，在非特异性丝裂原ConA刺激下，各组小鼠的脾淋巴细胞均呈现出高水平增殖反应，差异无统计学意义(P＞0.05)。在培养基RPMI1640刺激下，各组小鼠的脾淋巴细胞均无明显增殖，差异无统计学意义(P＞0.05)。在猪心肌肌凝蛋白刺激下，对照组小鼠的脾淋巴细胞无增殖反应，而实验组小鼠的脾淋巴细胞的增殖反应随时间变化，其中在第21天时反应水平最高，之后逐渐降低，且各组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 Real-time PCR检测 Real-time PCR检测结果如图5所示。B7-H4 mRNA的表达情况与心肌炎症程度、自身抗体滴度检测结果及淋巴细胞增殖实验结果相似。B7-H4 mRNA的相对表达量在第21及30天时最高，之后逐渐降低，但较正常组织均增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 对照组与实验组小鼠心肌组织HE染色(×200)Fig.1 Hematoxylin-eosin staining of heart in control group and experimental group(×200)

图2 对照组与实验组小鼠心肌组织免疫组织化学染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of heart in control group and experimental group(×400)

图4 各组小鼠淋巴细胞增殖实验结果Fig.4 Results of lymphocyte proliferation experiment in each group

图3 对照组与实验组小鼠血清抗心肌肌凝蛋白自身抗体滴度测定Fig.3 Serum titre determination of cardiac myosin autoantibody in controlgroup and experimental group

图5 各组小鼠心肌Real-time PCR结果Fig.5 Results of Real-time PCR in each group

3 讨论

病毒性心肌炎(VMC)是心血管系统常见疾病，其临床表现多种多样，既可完全没有症状，又可以导致猝死，部分患者可发生扩张性心肌病(DCM)，最终诱发心力衰竭，只能通过心脏移植的方式来缓解病情。目前VMC发生发展的确切机制尚未完全阐明，因此，无法在临床上及早发现并逆转病情的发展。目前普遍认为VMC的发病机制与病毒感染后病毒的直接损伤作用和心肌损伤后引起的自身免疫反应有关，其中可能又以自身免疫反应为主。

B7家族是重要的共刺激信号分子，既可以提供共刺激信号促进T细胞的活化，又可以提供共抑制信号限制T细胞活化。B7-H4是B7家族的新成员，在免疫反应中发挥免疫抑制作用，主要表达于活化的 T 细胞、B 细胞、树突状细胞、吞噬细胞等［3，7，8］。目前对B7-H4的研究主要集中于肿瘤方面，如肺癌［9］、卵巢癌［10］、肾细胞癌［10］、乳腺癌［12］、胃癌［13］等，B7-H4在这些癌症中均高表达。B7-H4在炎症方面的研究较少，主要集中于类风湿关节炎［5，6］、肾病［4，14，，15］、糖尿病［16］等自身免疫性疾病。而关于B7-H4在心肌炎中的表达情况尚未有相关研究。

在本研究中，我们用猪心肌肌凝蛋白构建了小鼠EAM模型，心肌切片HE染色结果及ELISA结果呈现出典型的心肌炎炎症改变，淋巴细胞增殖实验也呈现出与心肌炎症相同变化趋势，表明EAM模型成功建立。通过Real-time PCR的结果我们发现，实验组小鼠心肌组织中B7-H4 mRNA的相对表达量随心肌炎病程变化而变化，表明B7-H4参与了小鼠心肌炎的病程。通过小鼠心脏组织的免疫组化染色发现，B7-H4蛋白主要表达于心肌炎小鼠的心肌血管内皮细胞的细胞膜及细胞浆。但是与mRNA随病程变化的特点不同，B7-H4蛋白在心肌炎的不同时期，染色的阳性程度并无明显差异，提示B7-H4蛋白在患心肌炎的心肌组织中固定表达，并不随疾病的严重程度或者心肌组织中B7-H4 mRNA的相对表达量变化而变化。这与俞大亮等［15］在狼疮性肾炎肾组织中观察到的B7-H4的表达情况一致。俞大亮等发现，不同病理类型狼疮肾炎之间的B7-H4蛋白表达无差异。这种病变心肌中B7-H4蛋白与B7-H4 mRNA表达的不一致还有待进一步研究。

我们观察到B7-H4蛋白的阳性表达仅出现于心肌炎小鼠，在正常小鼠的心脏中并无表达。结合以往的研究我们推断有以下两种可能的机制导致这种现象的出现:①B7-H4蛋白表达增高是心肌炎症反应导致的反应性增高，从而发挥其免疫抑制作用，调节心肌炎病程。Kryczek等通过实验发现，IL-10可以诱导APCs表面B7-H4蛋白的表达，而B7-H4对T细胞也有免疫下调的作用;郭国宁等［5］发现B7-H4在类风湿关节炎患者中的病变关节内高表达，推断B7-H4蛋白的表达是患者体内免疫系统免疫活化后的结果，目的是抑制体内过高的免疫反应。②B7-H4在心肌炎病程中发挥的是B7家族分子的免疫活化作用，促进T细胞增殖及细胞因子分泌的作用，直接参与心肌炎病程。Chen等［4］通过实验证实，在多种自身免疫性肾病中，B7-H4蛋白均呈高表达，而在正常肾组织中并无表达，并且他们还发现B7-H4可以作为刺激因素活化共培养的T细胞，因此推断B7-H4如同其他B7家族成员一样，在公认的抑制免疫功能的作用之外，还具有促进T细胞增殖及细胞因子分泌的作用。但是，在心肌炎发病过程中具体是何种机制导致B7-H4蛋白表达增高还不明确，尚需要进一步研究加以确定。

综上所述，本实验结果表明B7-H4参与到了小鼠心肌炎的病理过程之中。心肌组织中B7-H4 mRNA的相对表达量随心肌炎病程的变化而变化。而B7-H4蛋白在心肌炎心肌中固定表达，并不随病情的变化而改变，而且B7-H4蛋白在心肌炎的小鼠中为高表达，在正常组织不表达。这为心肌炎的临床治疗提供了一种新的可能的治疗途径。

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