GPC3在癌症免疫治疗及诊断中的意义①

易达委 孙 斌 刘晓霓 陈德喜 王延军

(首都医科大学附属北京佑安医院，北京市肝病研究所，北京 100069)

肝细胞癌(HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。免疫治疗因其靶向性好，副作用少而广受关注，而鉴定一个有效的分子靶点则是肿瘤免疫治疗的关键。在此，我们将讨论磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的结构、功能和生物学特点，并将其作为癌症免疫疗法中药物作用靶点的潜能为讨论重点，研究其在人类癌症治疗中的作用。

GPC3是一种在HCC以及黑色素瘤等多种癌症中高度表达的膜蛋白，其基因编码的70 kD核心蛋白被前蛋白转换酶Furin酶切后，产生40 kD的氨基端亚单位和30 kD具有两条硫酸乙酰肝素(HS)链的羧基端亚单位。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI)锚定在细胞膜上(如图1所示)。羧基末端的膜结合蛋白可以被单克隆抗体(mAb)1G12识别。GPC3与Wnt及Hedgehog(HH)信号蛋白相关［1］。GPC3可以与Wnt信号分子形成一个复合体，并通过刺激Wnt信号促进肝癌生长。GPC3的突变将导致GPI锚定域的缺失，阻断Wnt信号通路，从而抑制依赖于Wnt信号的肿瘤生长。在人HEK-293细胞中制造出缺少 GPI锚定域的重组sGPC3蛋白，发现其能够抑制HCC的生长［2］，但不能排除是由于其他因素造成。实验中也发现，GPC3可通过与HH信号通路的相互作用，调节生长发育［1，3］。此外，GPC3 的 HS 链可以与 FGF-2 成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)相互作用，并调节生长因子的活性，在肝癌细胞中也发现了GPC3与FGF-2的相互作用现象［4］。

1 GPC3在人类恶性肿瘤中的表达

HCC和CCA是原发性肝癌的两种主要形式，越来越多的证据支持GPC3可作为肝细胞癌的一种新的肿瘤标志物。GPC3在肝癌组织中高表达，而胆管细胞癌及正常的肝组织中则不表达。GPC3在HepG2和 Hep3B 细胞，HT17、HuH6、Huh7和 PLC/PRF/5等HCC细胞株中均高度表达。利用单克隆抗体1G12检测或免疫组织化学方法检测［5，6］，可以在70%以上的肝细胞癌中发现GPC3，其余非肝细胞癌病例均为阴性，包括胆管癌、肝转移癌、肝细胞癌癌旁肝组织(包括肝硬化和血管瘤旁肝组织)。

图1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的结构示意图Fig.1 Schematic of the GPC3 protein.

由于发现GPC3阳性患者的5年生存率较GPC3阴性患者低(54.5%vs 87.7%，P=0.031)，具有显著统计学差异，证明GPC3的表达与肝细胞癌的预后不良情况密切相关［7］。在肝移植的患者中，血管侵犯与GPC3的表达显著相关，而没有GPC3表达的患者无复发生存期显著延长(P＜0.05)，表明GPC3 mRNA的过度表达可能是肝移植术后的不良指标。

GPC3也在黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤(YST)、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤细胞、睾丸非精原细胞瘤、脂肪肉瘤以及胃癌的特殊群体GPC3-GC中，也具有较低程度的表达。然而，目前GPC3在除HCC以外的其他人类肿瘤中诊断意义仍不明确。

2 GPC3与HCC诊断与预后检测

GPC3在HCC组织中高度表达，且检测阳性的患者，其血液中也可以检测到少量的GPC3［5］，因而血液中的GPC3含量将可能作为一种有效的诊断依据，并以此监测这些患者的病情发展。Filmus及其同事开发出了能与GPC3羧基端特异性结合的单克隆抗体1G12［5］。在泰国最近完成的一项研究中，利用单克隆抗体1G12检测，发现有53%HCC患者的血清中呈现明显的GPC3阳性，但在健康的血清提供者及肝炎患者的血清中则检测不到［8］。此外，GPC3还是HCC患者根治性切除后，用于预测肿瘤复发和总生存期的一种潜在的、可靠的生物标志物，高GPC3的表达是癌症复发的危险信号，而低表达的患者预后一般较好［9］。

AFP作为肝癌肿瘤标志物，受其敏感性和特异性限制，单独检测难以区别不同肝癌。而GPC3在HCC组织中高度表达，且在AFP阴性患者中也有很高检测率，其mRNA的阳性表达率高达70%［8］。研究显示，GPC3作为血清标志物与AFP联合检测诊断肝癌，可以提高诊断的敏感性［10］。

区分肝细胞癌与胆管细胞癌，尤其是肝内胆管细胞癌(ICC)，是一个至关重要的问题。GPC3在肝细胞癌中高度表达，而在肝内胆管细胞癌及胆囊癌中检测不到［11］。因此，这些研究表明GPC3具有作为原发性肝癌，尤其是肝细胞癌的诊断潜力［8，12］。如图2所示，大部分在肝细胞癌中表达的GPC3都表现出细胞质分布。相关研究表明，几乎一半的HCC病例表现出混合分布(细胞质和细胞膜)，而另一半仅表现为细胞质分布［7］。最近的一项研究利用HepG2的移植组织，完成了对GPC3免疫组化的组织处理方法的优化［13］。进一步的研究需要阐明是否不同分布的GPC3具有不同的功能意义和诊断价值。

3 以GPC3为靶点的免疫疗法

考虑到在肝癌，黑色素瘤和卵巢透明细胞癌的高度表达，GPC3被认为可作为潜在的靶点用于肿瘤免疫治疗。其对于抗GPC3抗体以及细胞基础的免疫疗法的有效性已经得到开发和探索［14］。

3.1 HCC的抗GPC3抗体疗法 抗GPC3抗体作为HCC免疫治疗的潜能日渐得到重视，许多特异性结合GPC3的单克隆抗体也相继被发现，包括1G12、M18D04、M19B11、A1836A 和 GPC3-C02 等。近年发现的人重链可变区抗体HN3与GPC3有较高亲和力，且对GPC3阳性细胞的增殖表现出明显的抑制作用［15］。另一高亲和力的单克隆抗体Yp7在裸鼠体内对肝癌移植瘤表现出了明显的生长抑制作用［16］。这些抗体在GPC3阳性HCC的免疫治疗方面表现出显著潜能。

第一个用于治疗的抗GPC3单克隆抗体GC33(IgG2a，κ)，其抗原表位位于羧基末端［14，17］。这一抗体在皮下异位移植 HepG2 和HuH-7移植瘤的小鼠中，诱导产生了抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，并展现出抑制肿瘤生长的作用。GC33诱导的ADCC抗肿瘤活性主要是由自然杀伤细胞产生［14］。GC33同样能够减少在肝内原位移植HepG2细胞的小鼠血液中甲胎蛋白的含量。通过CDR移植法制造出的人源GC33(hGC33)与GC33一样对HepG2的移植有作用［18］。另一方面，相关研究发现了GPC3的膜表达与肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)相关［19，20］。在这些证据的基础上，Takai等观察到在使用GC33的抗GPC3免疫治疗模型中，存在TAM侵入，表明巨噬细胞可能在GC33抗体的肿瘤活性中起到重要作用，而抗肿瘤活性可能通过调节GPC3功能，而不是ADCC机制发挥效应。此外，GC33不能直接抑制GPC3阳性肿瘤细胞的增殖。曾有人提出，抗GPC3抗体可能会增加肝细胞癌对化疗药物的敏感性。最近hGC33与标准化疗剂相结合的抗肿瘤活性已受重视。在HepG2的移植瘤模型中，hGC33和索拉非尼相结合时比单独使用索拉非尼更能有效地抑制肿瘤的生长。这种组合方案可能作为一种肝癌的治疗方式，具有很高的临床应用价值。

图2 GPC3在人原发性肝癌中的表达Fig.2 GPC3 expression in human primary liver cancer

基于这些结果，以HCC晚期治疗为对象的Ⅰ期临床试验已进行评估。该研究表明，患者对GC33耐受性良好，且副作用与剂量相关，每周安全的静脉给药量为20 mg左右［22］。目前Ⅱ期临床试验正在招募之中:www.clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT01507168。

3.2 GPC3合成肽疫苗 在皮下异位移植肿瘤的小鼠身上，由于转入了鼠GPC3基因的Colon26细胞系，其转录的GPC3肽段或GPC3特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可通过树突状细胞引起小鼠的保护作用［23］。这项工作表明GPC3在小鼠中具有高度的免疫原性，可以诱导有效的抗肿瘤免疫反应，并不产生自身免疫性疾病。但有数据显示，CD8+T细胞定向性癌症疫苗在HCC的治疗中，疗效有限(除非能够鉴定出应答产生的最佳共刺激信号)，而CD4+T细胞定向性癌症疫苗则值得开发利用［24］。

在HLA-A2.1转基因小鼠中，GPC3疫苗可以诱导产生肽反应性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并且不产生自身免疫反应［25］。此外，接种这些CTL的NOD/SCID小鼠其肝癌移植瘤的生长受到显著抑制。在这些结果的基础上进行了Ⅰ期临床试验，发现接种疫苗的耐受性良好，且在33例中有30例患者产生了可检测的免疫应答反应，且免疫应答的水平与总生存期之间有一定相关性［26］。目前正在进行Ⅱ期临床试验，并计划将GPC3合成肽疫苗与化疗相结合［26］。

3.3 GPC3功能阻断 除上述的免疫治疗方法外，还有相关研究试图通过阻断GPC3的功能来达到治疗目的［27］。最近发现，突变型GPC3由于缺少GPI不能附着于细胞膜，以致被排出到细胞外液而减少膜上的Wnt信号，并减少其与G蛋白偶联受体的结合。此外，还发现异位的突变型GPC3能够抑制几种肝癌细胞株在体内外的生长。除了抑制Wnt信号之外，在某些细胞株中由于GPC3的外排，导致其通过HS链结合的生长因子也被从细胞膜上清除［27］。另一项研究表明，用重组蛋白处理HCC细胞能够抑制突变型GPC3的功能和活性［2］。

4 结论

由于GPC3在肝细胞癌中的高度表达，目前其被认为可作为HCC抗体和细胞疗法的靶点。将来工作的方向可能是研制出新一代的GPC3单克隆抗体，这种单抗能够靶向于包括HS链等在内的多种功能域，与GPC3相结合;并在实验中检验抗GPC3单克隆抗体能否通过阻断Wnt信号和/或其他信号途径中的配体与受体的相互作用，来直接抑制肿瘤生长。此外，最新的研究表明，血清型GPC3可能具有肿瘤标志物价值，能够在肿瘤诊断和表达GPC3的恶性肿瘤患者的后续观察中发挥作用。然而，血清GPC3的生化性质仍然在研究之中。而对于GPC3的三维结构和GPC3从癌细胞脱落的分子机制将很有研究价值。此外，免疫组化的研究表明，GPC3还具有肿瘤诊断的病理学价值。通过各种高危人群的大量病例，对GPC3本身或GPC3与其他肿瘤蛋白相组合的进一步研究，能够验证使用GPC3作为HCC以及其他表达GPC3肿瘤的诊断标志物的重要价值。

［1］Capurro MI，Xu P，Shi W，et al.Glypican-3 inhibits Hedgehog signaling during development by competing with patched for Hedgehog binding ［J］.Developmental Cell，2008，14(5):700-711.

［2］Feng M，Kim H，Phung Y，et al.Recombinant soluble glypican 3 protein inhibits the growth of hepatocellular carcinoma in vitro［J］.Inter J Cancer J Inter du cancer，2011，128(9):2246-2247.

［3］Capurro MI，Li F，Filmus J.Overgrowth of a mouse model of Simpson-Golabi-Behmel syndrome is partly mediated by Indian hedgehog［J］.EMBO Reports，2009，10(8):901-907.

［4］Lai JP，Sandhu DS，Yu C，et al.Sulfatase 2 up-regulates glypican 3，promotes fibroblast growth factor signaling，and decreases survival in hepatocellular carcinoma ［J］.Hepatology，2008，47(4):1211-1222.

［5］Capurro M，Wanless IR，Sherman M，et al.Glypican-3:a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma［J］.Gastroenterology，2003，125(1):89-97.

［6］Wang YL，Zhu ZJ，Teng DH，et al.Glypican-3 expression and its relationship with recurrence of HCC after liver transplantation［J］.World J Gastroenterol:WJG，2012，18(19):2408-2414.

［7］Shirakawa H，Suzuki H，Shimomura M，et al.Glypican-3 expression is correlated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer science，2009，100(8):1403-1407.

［8］Tangkijvanich P，Chanmee T，Komtong S，et al.Diagnostic role of serum glypican-3 in differentiating hepatocellular carcinoma from non-malignant chronic liver disease and other liver cancers［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25(1):129-137.

［9］Fu SJ，Qi CY，Xiao WK，et al.Glypican-3 is a potential prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma after curative resection［J］.Surgery，2013，154(3):536-544.

［10］XU C，YAN Z，ZHOU L，et al.A comparison of glypican-3 with alpha-fetoprotein as a serum marker for hepatocellular carcinoma:a meta-analysis［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2013，139(8):1417-1424.

［11］YU J，MA Q，ZHANG B，et al.Clinical application of specific anti-body against glypican-3 for hepatocellular carcinoma diagnosis［J］.Sci China Life Sciences，2013，56(3):234-239.

［12］Man XB，Tang L，Zhang BH，et al.Upregulation of Glypican-3 expression in hepatocellularcarcinoma butdownregulation in cholangiocarcinoma indicates its differential diagnosis value in primary liver cancers［J］.Liver international:official journal of the International Association for the Study of the Liver，2005，25(5):962-966.

［13］Takai H，Kato A，Ishiguro T，et al.Optimization of tissue processing forimmunohistochemistry forthe detection ofhuman glypican-3 ［J］.Acta histochemica，2010，112(3):240-250.

［14］Ishiguro T，Sugimoto M，Kinoshita Y，et al.Anti-glypican 3 antibody as a potential antitumor agent for human liver cancer［J］.Cancer research，2008，68(23):9832-9838.

［15］Feng M，Gao W，Wang R，et al.Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110(12):E1083-E1091.

［16］Phung Y，Gao W，Man YG，et al.High-affinity monoclonal antibodies to cell surface tumor antigen glypican-3 generated through a combination of peptide immunization and flow cytometry screening［J］.mAbs，2012，4(5):592-599.

［17］Nakano K，Orita T，Nezu J，et al.Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells ［J］.Biochemi Biophysical Rese Communications，2009，378(2):279-284.

［18］Nakano K，Ishiguro T，Konishi H，et al.Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization ［J］.Anti-cancer drugs，2010，21(10):907-916.

［19］Takai H，Kato A，Kato C，et al.The expression profile of glypican-3 and its relation to macrophage population in human hepatocellular carcinoma［J］.Liver International:official journal of the International Association for the Study of the Liver，2009，29(7):1056-1064.

［20］Takai H，Aahihara M，Ishiguro T，et al.Involvement of glypican-3 in the recruitment of M2-polarized tumor-associated macrophages in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Biology ＆ Therapy，2009，8(24):2329-2338.

［21］Takai H，Kato A，Kinoshita Y，et al.Histopathological analyses of the antitumor activity of anti-glypican-3 antibody(GC33)in human livercancerxenograftmodels:The contribution of macrophages［J］.Cancer Biol ＆ Therapy，2009，8(10):930-938.

［22］Zhu AX，Gold PJ，EL-Khoueiry AB，et al.First-in-man phase I study of GC33，a novel recombinant humanized antibody against glypican-3，in patients with advanced hepatocellular carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2013，19(4):920-928.

［23］Nakatsura T，Komori H，Kubo T，et al.Mouse homologue of a novel human oncofetal antigen，glypican-3，evokes T-cell-mediated tumor rejection without autoimmune reactions in mice ［J］.Clin Cancer Res，2004，10(24):8630-8640.

［24］XU Y，LI H，GAO RL，et al.Expansion of interferon-gammaproducing multifunctional CD4+T-cells and dysfunctional CD8+T-cells by glypican-3 peptide library in hepatocellular carcinoma patients［J］.Clini Immunol，2011，139(3):302-313.

［25］Komori H，Nakatsura T，Ssnju S，et al.Identification of HLA-A2-or HLA-A24-restricted CTL epitopes possibly useful for glypican-3-specific immunotherapy of hepatocellular carcinoma ［J］.Clin Cancer Res，2006，12(9):2689-2697.

［26］Sawada Y，Yoshikawa T，Nobuoka D，et al.Phase I trial of a gly pican-3-derived peptidevaccineforadvanced hepatocellular carcinoma:immunologic evidence and potential for improving overall survival ［J］.Clin CancerRes，2012，18(13):3686-3696.

［27］Zittermann SI，Capurro MI，Shi W，et al.Soluble glypican 3 inhibits the growth of hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo［J］.Intern J Cancer J International du cancer，2010，126(6):1291-1301.