粉尘螨重组过敏原 Der f 11(副肌球蛋白)克隆表达、纯化及免疫学鉴定①

蒋聪利 邬玉兰 幸 鹏 杨平常 刘志刚(深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，深圳 518060)

尘螨(HDM)是人们居住环境中接触性和吸附性过敏原的重要来源之一，其中户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和粉尘螨(Dermatophagoides farinae)是主要螨种。通过皮肤反应性测试、支气管激发测试、血清检测等方法鉴定螨特异性IgE和嗜碱性粒细胞组胺释放，已证明尘螨与支气管哮喘有紧密关系［1］。第1、2组过敏原是众所周知的尘螨主要过敏原，但有20%的螨过敏性患者体内无抗一组和二组过敏原的特异性IgE，而在尘螨体内含量较低的其他部分过敏原有较高的IgE结合性，故需研究多种尘螨重组过敏原以制备出代表性的混合重组过敏原疫苗［2］。目前，粉尘螨中已报道有十六种过敏原(Der f 1-3，5-7，10，11，13-18，22，24)［3］。其中大部分分子量集中在14～60 kD之间，而Der f 11分子量为98 kD，是与肌肉相关的高分子量蛋白。国外报道认为Der f 11是寄生虫体内的重要过敏原，可以作为尘螨过敏性疫苗制备的备用成分［4］。国内暂无关于Der f 11的任何报道，本研究通过合成Der f 11基因，构建其表达载体，大量表达出Der f 11蛋白，通过免疫印迹检测尘螨过敏性患者血清内特异性IgE，从而鉴定其免疫原性，为我国粉尘螨疫苗的标准化制备奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒载体和表达菌 质粒载体pET-32a购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)，大肠埃希菌BL21(DE3)由深圳大学过敏反应与免疫学研究所提供。

1.1.2 主要实验材料 尘螨患者血清取自广州医学院第二附属医院变态反应科，存放于－20℃冰箱备用。限制性内切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ购自大连宝生物TaKaRa公司。生物素标记的小鼠抗人IgE抗体及HRP标记的链霉亲和素均购自美国Southern Biotech公司。DAB底物显色试剂盒购自凯基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 基因合成和克隆载体的构建 通过分析比对深圳大学与香港中文大学合作所测出来的粉尘螨全基因组序列，获得粉尘螨Der f 11的基因序列，由华大基因公司合成该基因并连接至克隆载体pMD18-T。然后将重组质粒转化进大肠埃希菌E-.coli Top10，酶切鉴定后将阳性克隆送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

将测序所得序列通过NCBI数据库推导其相应氨基酸序列，对该蛋白质的等电点和相对分子量利用在线程序进行评估(http://web.expasy.org/compute_pi/)。将克隆得到的粉尘螨Der f 11基因与GenBank公布的其他物种的同种蛋白的基因序列进行同源性分析。

1.2.2 构建重组表达质粒和酶切鉴定 将pMD18-T-Der f 11阳性质粒与原核表达载体pET-32a分别用限制性内切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切，将Der f 11基因片段与pET-32a的酶切产物连接，构建重组表达质粒pET-32a-Der f 11。将重组质粒转化入感受态E.coli Top10，碱裂解法提取质粒后用Eco RⅠ和Bam HⅠ进行双酶切，测序鉴定后用于诱导表达。

1.2.3 重组蛋白Der f 11的表达 重组表达质粒pET-32(+)-Der f 11转入感受态大肠埃希菌BL21后，涂板培养过夜，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振摇过夜，取2 ml菌液至新鲜LB培养液中，37℃，200 r/min摇菌至OD600为0.6左右时，按体积比1∶1 000加入0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，将转速调至125 r/min，摇菌8 h后，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，收集细菌沉淀。超声破碎后，进行SDS-PAGE电泳，检测重组Der f 11蛋白的表达情况。

1.2.4 重组蛋白Der f 11的纯化 参照美国GE公司Ni-NAT martrix柱使用说明，将收集的菌液经超声裂解，离心，将上清液以2 ml/min的流速上样于预平衡好的Ni-NAT柱，上样完毕后，先用平衡缓冲液充分洗柱，然后用40 mmol/L的咪唑缓冲液洗去杂质蛋白。最后用300 mmol/L咪唑缓冲液对目的蛋白进行洗脱，取样进行SDS-PAGE分析。

1.2.5 蛋白质免疫印迹分析(Western blot) 用15份粉尘螨过敏性患者的混合血清和单人份血清分别作为一抗。将获得的纯化后的重组Der f 11蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后电转至PVDF膜上，用含3%胎牛血清的TBST 4℃封闭过夜;TBST洗后，与1∶5稀释的患者血清37℃，孵育2 h;洗后，加入经TBST(1∶2 000)稀释的生物素标记的小鼠抗人IgE抗体，37℃，孵育2 h;洗后，加入经TBST(1∶5 000)稀释的HRP标记的链霉亲和素，37℃，孵育2 h;充分洗涤后，用四甲基联苯胺(TMB)显色，至条带显出后用蒸馏水冲洗终止反应。检测Der f 11是否有免疫原性及其与尘螨过敏性患者的IgE结合率。

2 结果

2.1 粉尘螨Der f 11基因序列和测序鉴定 将酶切鉴定为阳性克隆的重组质粒测序后，结果显示:粉尘螨Der f 11基因开放阅读框为2 631 bp，编码876个氨基酸(图1)。粉尘螨基因组测序发现本实验室克隆的Der f 11基因与GenBank上公布的屋尘螨Der p 11及热带无爪螨Blo t 11同源性为99%。

2.2 表达载体pET-32a(+)-Der f 11的构建和酶切鉴定 将测序正确的Der f 11基因连接到pET-32a表达载体后，用EcoR I和BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆，核酸电泳结果显示与Der f 11的cDNA长度(2 631 bp)基本一致(图2)，证明表达重组质粒pET-32a(+)-Der f 11构建成功。

2.3 重组Der f 11蛋白的表达和纯化 将pET-32a(+)-Der f 11重组表达质粒转入表达菌BL21，用0.1 mmol/L的IPTG诱导表达后，采用Ni+柱亲和层析的方法纯化Der f 11蛋白，经SDS-PAGE电泳。结果显示:分子质量约118 ku处有外源蛋白条带出现，且纯化后纯度较高，该蛋白条带的分子质量与Der f 11蛋白理论分子质量基本相符(图3)。

图1 由粉尘螨Der f 11 cDNA序列推导出的氨基酸序列Fig.1 Deduced amino acid sequence from dust mite Der f 11 cDNA

图2 表达载体ET32a(+)-Der f 11酶切鉴定Fig.2 Restriction enzymes digestion-analysis of recombin ant plasmidpET32-Der f 11

图3 重组蛋白Der f 11的表达和纯化Fig.3 Expression and purification of recombinant protein Der f 11

图4 重组蛋白Der f5Der f 11的免疫印迹分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant Der f 11

2.4 重组蛋白Der f 11免疫原性的鉴定 将该重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转膜，进行Western blot鉴定实验，结果显示:Der f 11重组蛋白能与患者血清的IgE发生特异性结合(图4A)，在15份尘螨过敏性患者血清中，其中3份血清与重组Der f 11产生较明显反应(图4B)。

3 讨论

尘螨是引起变态反应性疾病包括哮喘、鼻炎及过敏性皮炎的重要原因之一。国内有研究者进行了大规模人群的变应原皮肤点刺检测，尘螨过敏原阳性率明显高于其他过敏原［5，6］。针对尘螨引起的过敏性疾病的治疗方法中，特异性免疫治疗法(SIT)是从病因学出发且能改变过敏性疾病自然病程的治疗方法［7］。其中用粉尘螨疫苗进行舌下免疫治疗单一过敏性鼻炎患者和多过敏性鼻炎患者一年半至两年内均呈现显著疗效［8］，免疫疗法能有效提高过敏性疾病患者的生活质量和减少其患病天数。而重组过敏原是过敏原新型免疫治疗和诊断方法发展的基础，其最优势是能够使疫苗标准化，得到可定量组分的平衡配方，从而免除非过敏原成分引起的炎症等副作用［9］。粉尘螨Der f 11是分子量较高的副肌球蛋白，在羊痂螨虫［10］、热带无爪螨中副肌球蛋白均被报道是一种免疫原性较强的重要过敏原，热带无爪螨中重组Blo t 11蛋白与过敏性患者血清中特异性IgE结合性较天然Blo t 11蛋白低，降低了其变应原性［11］。国外学者报道了关于粉尘螨副肌球蛋白的cDNA序列及利用pGEX-2T表达载体在大肠杆菌内进行表达，其cDNA序列全长2 134 bp，编码711个氨基酸［12］。而国内尚未有关于中国地区粉尘螨体内副肌球蛋白(Der f 11)的研究，本研究使用的粉尘螨Der f 11 cDNA基因序列全长为2 632 bp，可编码876个氨基酸，通过同源性分析比对，与屋尘螨、疥螨、热带无爪螨等常见螨种同源性均高达99%。

将公司合成的粉尘螨Der f 11基因连接到pMD18-T载体上，经双酶切和测序均证实已获得了正确的Der f 11基因。将该片段连接到原核表达载体pET-32a上，导入大肠杆菌BL21(DE3)内，丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，经SDS-PAGE分析，表明重组蛋白在宿主大肠埃希菌中能得到高效表达。利用pET-32a载体带有His标签的特性，选用亲和层析柱进行纯化，得到纯度较高的蛋白后，使用15份尘螨过敏患者的混合血清进行Western blot实验，结果表明重组的Der f 11能和尘螨过敏患者血清中的IgE结合，说明重组变应原具有较好的抗原性。将15份血清分别进行Western blot实验后，其中3份血清显示出明显印迹条带，过敏性患者血清中特异性IgE的结合率20%(3/15)，较国外50%的特异性IgE结合率低［12］，此原因可能是粉尘螨物种的地域性差异和采取的过敏性人群血清样本的不同。此研究证明了粉尘螨Der f 11可作为尘螨疫苗制备的候选蛋白。

制备重组蛋白比天然蛋白周期短，成本低等优点，本研究将粉尘螨Der f 11基因在大肠杆菌内表达，制备纯化出具有天然免疫活性的重组蛋白Der f 11，为实现粉尘螨变应原的标准化，特异性诊断和免疫治疗奠定了基础。

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