PRRSV感染PAM中猪FcγRⅢ介导的免疫抑制反应①

李娜娜 王冬梅 杜东颖 秦运杰 夏平安 杨明凡 崔保安

(河南农业大学牧医工程学院兽医微生物实验室，郑州 450002)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是二十世纪八十年代末发现的一种高度传染性疾病，引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪的呼吸道疾病［1］。PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，单股正链RNA病毒，大小约15 kb，编码9个开放阅读框［2］。PRRSV有严格的组织嗜性，只感染血液中PAM(Pulmonary alveolar macrophages)细胞和单核细胞，能够在宿主体内自主复制［3-6］。在体外可感染非洲绿猴肾细胞系如Marc-145细胞、骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)、单核细胞源性巨噬细胞(Monocyte-derived macrophages，MDM)［7-9］。巨噬细胞和树突状细胞在免疫应答中发挥着重要作用，能够产生大量的细胞因子。许多研究资料表明，PRRSV感染宿主后抗病毒细胞因子水平下调［8，10］。猪感染 PRRSV后机体快速调动其体液免疫，但是早期亚中和抗体和非中和抗体通过ADE(Antibody-dependent enhancement)作用严重影响PRRS的发展，使病毒更容易通过IgG Fc受体(FcγR)介导的细胞吞噬作用被单核细胞、巨噬细胞吸附和内吞，从而进入宿主细胞内［11-15］。

IgG Fc受体属于IgG基因超家族成员，是免疫应答中重要的膜性调节分子，主要表达于NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等，主要是通过与配体结合来发挥某些重要的生物学效应，例如参与抗原的处理和递呈，抗体依赖性细胞毒作用(Antibody dependent cytotoxicity ，ADCC)，细胞因子的产生，免疫应答反应和信号转导等免疫识别与清除作用［16］。根据配体的特异性可分为 IgG受体(FcγR)、IgA 受体(FcaR)、IgE 受体(FcεR)、IgM 受体(FcμR)和 IgD 受体(FcδR)。目前鉴定的 FcγR有 FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、boFcγRⅡ和 moFcγRⅣ等五个亚类［17］。其中 FcγRⅢ(CD16)含有 2个 Ig样胞外区结构域，为中低亲和力受体，是唯一在NK细胞上发现的Fc受体［18］。本实验室成功地从猪PAM细胞克隆出FcγRⅢ(CD16)并制备其多克隆抗体［19］，为本实验奠定基础。

本试验通过研究FcγRⅢ的选择性激活对在宿主细胞的抗病毒因子水平的影响，来研究在PRRSV感染过程中的FcγRⅢ介导的免疫反应作用。

1 材料与方法

1.1 毒株、抗体与实验动物 PRRSV Hn-1/06株(TCID50为10－4.6/0.1 ml)为本实验室分离并保存;纯化鼠抗猪 FcγRⅢ IgG(ELISA检测抗体效价1∶12 800)由本实验室制备并保存;PRRSV抗原、抗体均为阴性的20日龄健康大白仔猪，购自郑州某猪场。

1.2 主要试剂 Reverse Transcriptase M-MLV、dNTPs、Ribonuclease Inhibitor、Trizol、SYBR Premix Ex Taq等购自TaKaRa公司;LPS购于Sigma公司;RPMI1640培养基干粉购自Gibco公司;新生牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 PAM细胞的制备 按照徐红运等［20］的方法获取PAM细胞，重悬于10%血清的RPMI1640中。调整细胞浓度至5×106个/ml，加入24孔细胞培养板，0.5 ml/孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养约6 h，弃去未贴壁的细胞，用 PBS液洗板一次，加入10%血清 RPMI1640营养液，置于37℃、5%CO2温箱培养。

1.3.2 PRRSV感染PAM试验 将含有200个TCID50的PRRSV 接种 PAM 细胞，感染12、24、36、48、60、72 h 后分别收集细胞培养液，用段二珍［21］建立的Real-time qPCR方法检测感染不同时间段PAM细胞中PRRSV的拷贝数(绝对定量);用张宜娜［22］建立的Real-time qPCR方法检测不同时间段PAM细胞中IFN-α、TNF-α mRNA转录水平(相对定量)。同时设对照细胞组。

1.3.3 LPS刺激PAM细胞试验 将终浓度100 ng/ml LPS［23］接种 PAM 细胞，作用 12、24、36、48、60、72 h后分别收集细胞培养液，用张宜娜建立的Real-time qPCR方法分别检测不同时间段PAM细胞中 IFN-α、TNF-α mRNA 转录水平。

1.3.4 FcγRⅢ对PAM细胞中细胞因子转录水平影响试验 将纯化鼠抗猪FcγRⅢ IgG(550 μg/ml)接种到 PAM 细胞上，200 μl/孔，置 37℃、5%CO2条件下作用1 h，取出细胞培养板，弃去上清液。每孔加入 500 μl 10%血清 RPMI1640 营养液，12、24、36、48、60、72 h后分别收集细胞培养液，用张宜娜建立的Real-time qPCR方法检测不同时间段PAM细胞中 IFN-α、TNF-α mRNA 转录水平。

1.3.5 FcγRⅢ的选择性激活试验 将纯化鼠抗猪FcγRⅢ IgG(550 μg/ml)接种到 PAM 细胞上，200 μl/孔，置 37℃、5%CO2条件下作用 1 h，取出细胞培养板，弃去上清液。然后将含有200个TCID50的PRRSV接种处理的 PAM细胞上，感染 12、24、36、48、60、72 h 后分别收集细胞培养液，检测方法同1.3.2。

1.3.6 数据处理方法 每个检测样品做3个平行，绝对定量所得结果，即PRRSV拷贝数，用建立的标准曲线进行计算。相对定量所得结果用2－ΔCT法进行比较，即ΔCT=CT目的基因-CT持家基因。以 β-actin为持家基因。用 GraphPad Prism 5软件进行数据处理。

2 结果

2.1 PRRSV在PAM细胞中的增殖规律 如图1所示PRRSV感染PAM细胞后，48 h PRRSV的拷贝数最高可达到1.34E+06，之后PRRSV的拷贝数下降。

2.2 PRRSV对PAM细胞中抗病毒细胞因子转录水平的影响 应用实时荧光定量PCR方法检测PRRV、LPS诱导PAM细胞和未处理对照组PAM细胞在 12、24、36、48、60、72 h 后 IFN-α、TNF-α mRNA转录水平的变化，确定PRRSV引起宿主细胞的先天抗病毒反应。如图2显示，LPS处理组IFN-α、TNF-α mRNA转录水平与对照组细胞相比均上调。接种病毒组IFN-α mRNA转录水平在PRRSV感染PAM细胞12、24 h后与对照组细胞相比显著上调，分别上调1.46倍和1.35倍，感染36、48、60 h后 IFN-α mRNA转录水平下降，分别是其0.71倍、0.78倍、0.70倍、72 h后恢复对照组细胞水平。TNF-α mRNA 转录水平在 PRRSV 感染12、24、36、48、60、72 h后均高于对照组细胞，达1.15～2.49倍，在48 h后差异最大，达到2.49倍。

2.3 FcγRⅢ对PAM细胞中抗病毒细胞因子转录水平的影响 为研究FcγRⅢ引起宿主细胞的先天抗病毒反应，用纯化的鼠抗猪FcγRⅢIgG选择性激活 PAM 细胞 FcγRⅢ受体，在 12、24、36、48、60、72 h后检测IFN-α、TNF-α mRNA转录水平的变化。如图3 显示，选择性激活猪 FcγRⅢ后 IFN-α、TNF-α mRNA 转录水平在 12、24、36、48、60、72 h 均显著低于对照组细胞，与对照组细胞相比，IFN-α mRNA转录水平是其0.21～0.26倍，在24 h最低;TNF-α mRNA转录水平是其0.15～0.31倍，在36 h最低，这些数据表明选择性激活FcγRⅢ能够抑制宿主细胞的先天性免疫。

2.4 选择性激活FcγRⅢ后PRRSV对PAM细胞中抗病毒细胞因子转录水平的影响 鼠抗猪FcγRⅢIgG处理PAM细胞后接种PRRSV，在培养12、24、36、48、60、72 h后收集细胞，利用已经建立实时荧光定量PCR方法检测不同时间段PAM细胞IFN-α、TNF-α mRNA转录水平的变化。如图4所示FcγRⅢIgG选择性激活PAM后感染PRRSV，与对照组PRRSV感染PAM细胞组相比，IFN-α mRNA转录水平在12～72 h期间显著下降，是其0.09～0.52倍;TNF-α mRNA转录水平在12～72 h期间显著下降，是其0.02～0.21倍。这些数据显示猪FcγRⅢ介导PRRSV感染抑制宿主细胞抗病毒因子转录水平。

2.5 选择性激活猪FcγRⅢ对PRRSV在PAM细胞中增殖的影响 为研究选择性激活 FcγRⅢ对PRRSV增殖规律的影响，用纯化鼠抗猪 FcγRⅢIgG 处理PAM细胞后接种PRRSV，在感染12、24、36、48、60、72 h后用已建立的Real-time qPCR方法检测感染不同时间段PAM细胞中PRRSV的拷贝数。如图5所示，选择性激活 FcγRⅢ后 PAM细胞中的PRRSV的拷贝数与单纯接毒的PAM细胞相比在12、24、36、48、60、72 h 显著升高，高 3.74～ 148.93倍，72 h是最高，达到148.93倍。这些数据说明选择性激活FcγRⅢ能够增强PRRSV在PAM细胞中的复制水平。

图1PAM细胞中PRRSV拷贝数Fig.1 Copies of viral replication in porcine PAM cells

图2 PRRSV感染细胞、LPS处理细胞、健康细胞IFN-α、TNF-α mRNA转录水平变化Fig.2 IFN-α and TNF-α mRNA levels in PRRSV infected cells or LPS stimulated cells or mock normal cells

图3 选择性激活FcγRⅢ诱导PAM细胞IFN-α、TNF-α mRNA转录水平变化Fig.3 IFN-α and TNF-α mRNA levels in procine PAM cells pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

图4 选择性激活FcγRⅢ处理PAM细胞后接种PRRSV诱导IFN-α、TNF-α mRNA转录水平变化Fig.4 IFN-α and TNF-α mRNA levels in PRRSV infected cells pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

图5 选择性激活FcγRⅢ后PRRSV拷贝数Fig.5 Copies of viral replication in porcine PAM cells，pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

3 讨论

本试验主要是用已经建立的实时荧光定量PCR方法检测不同方法处理的PAM细胞中IFN-α、TNF-α mRNA转录水平变化和PRRSV拷贝数的变化，来探讨FcγRⅢ介导PRRSV诱导的免疫抑制反应。FcγRⅢ(CD16)为中等亲和力的抗体结合受体，含有2个Ig样胞外区结构域，是唯一在NK细胞上发现的Fc受体。它由两个不同的基因编码，它们在不同细胞类型上选择性表达。在单核细胞、巨噬细胞、NK细胞表面上表达的是一种被称为FcγRⅢA的跨膜糖蛋白，另一个FcγRⅢ基因编码表达糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol，GPI)连接的蛋白质，称为FcγRⅢB，它只在嗜中性粒细胞上表达。主要是过FcR-γ链，以及与其相连的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的相互作用触发细胞活化，FcγRⅢ能够触发多种免疫反应，包括清除免疫复合物、吞噬作用、ADCC、释放炎性介质、增强抗原提呈等作用。

PRRSV感染PAM细胞后，IFN-α mRNA转录水平在PRRSV感染PAM细胞12、24 h后与对照细胞相比显著上调，感染36、48、60 h后 IFN-α mRNA 转录水平下降;TNF-α mRNA转录水平在PRRSV感染12、24、36、48、60、72 h 后均高于对照细胞组。有报道显示，PRRSV通过阻碍 ISGF 3的核转位阻止Ⅰ型干扰素的活化和信号转导通路，抑制IFN-α的产生［24］，但是不同的毒株对IFN-α敏感性和诱导IFN-α的能力不同;而有研究显示PRRSV诱导TNF-α产生迟缓或者下调，我们的研究表明PRRSV感染前期IFN-α mRNA转录水平与对照组相比上调1.35～1.46倍，感染后期 IFN-α mRNA转录水平下调0.70～0.78倍;而TNF-α mRNA转录水平在72 h内上调1.15～2.49倍。原因可能是不同的分离株对IFN-α、TNF-α转录水平的影响不同，而实验过程中所选择的观察时间段也会影响实验结果。本试验表明，选择性激活 FcγRⅢ后，IFN-α、TNF-α mRNA 转录水平在72 h内与对照细胞相比均显著下调;同时选择性激活 FcγRⅢ后接种 PRRSV，72 h内与PRRSV对照组相比 IFN-α、TNF-α mRNA转录水平也显著下调。而我们之前的研究显示选择性激活抑制性受体FcγRⅡB在PRRSV感染后能够显著提高抗病毒因子的 mRNA 转录水平［25］;Thomas等［25］研究显示巴西利什曼原虫感染FcγRⅢ缺陷小鼠后，发现FcγRⅢ缺陷小鼠能够抵抗巴西利什曼原虫感染，同时 IFN-γ mRNA转录水平显著上调，而 IL-10 mRNA转录水平下调。由此推测选择性激活 FcγRⅢ能够抑制宿主细胞的先天性免疫，FcγRⅢ能够抑制PRRSV感染后的抗病毒免疫反应。有资料显示巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用主要由FcγR介导，而缺失 FcγR可致巨噬细胞的吞噬作用丧失［26］。由此我们推测选择性激活 PAM细胞的FcγRⅢ后，增强PAM细胞吞噬PRRSV的能力，促进病毒进入PAM细胞，加强PRRSV在细胞内复制。本试验证明，选择性激活FcγRⅢ后再感染PRRSV，72 h内PRRSV的拷贝数与病毒对照组相比显著提高，这可能是由于选择性激活 FcγRⅢ后，能抑制PAM细胞中抗病毒因子水平，同时促进PAM细胞对PRRSV吞噬作用所致。

实验结果表明，PRRSV感染PAM细胞后48 h病毒的拷贝数最高，随后逐渐下降，PRRSV能够抑制IFN-α mRNA转录水平，诱导增强 TNF-α mRNA转录水平;FcγRⅢ能够抑制 PRRSV感染后的抗病毒免疫反应并增强PRRSV在PAM细胞中的复制。本次研究探讨了FcγRⅢ介导PRRSV的免疫抑制反应，为研究FcγR途径介导PRRSV增强病毒感染的作用机制提供了依据。

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