杀二斑叶螨高毒力环链棒束孢菌株的筛选及其对尼氏真绥螨的影响

张晓娜，金道超，邹 晓，王思潮，瞿娇娇，郭建军*

(1.贵州大学昆虫研究所/贵州山地农业病虫害重点实验室，贵阳 550025;2.贵州大学真菌资源研究所，贵阳 550025)

二斑叶螨Tetranychus urticae (Koch，1836)是重要的世界经济害螨，我国上世纪50年代发现，目前已几乎分布于全国，危害包括蔬菜、玉米、棉花、果树及花卉等1100 余种植物，造成严重的经济损失(Grbic et al.，2011)。由于其个体小，繁殖率高，抗性增长快等特点，一旦暴发对农作物危害严重(刘庆娟等，2012)。随着科学水平和人们环保意识的不断提高，二斑叶螨的生物防治越来越受到重视(罗华东等，2011)目前采用的生物防治方法主要有天敌防治和微生物制剂防治。

尼氏真绥螨Euseius nicholsi (Ehara et Lee)是多种经济作物害螨的有效天敌，目前只发现于中国和东南亚的泰国，由于该螨发育历期短，繁殖速度快，雌成螨寿命长，捕食范围广，食量大等优点，其具有很大的发展前景(秦素研和刘怀，2006;胡展育等，2007)。研究发现该螨对二斑叶螨(陈文龙等，1996)、朱砂叶螨(秦素研和刘怀，2006)、柑橘全爪螨(凌鹏等，2008)等害螨都有良好的控制作用。

环链棒束孢 Isaria cateniannulata (Liang)Samson ＆ Hywel-Jones 是一种重要的昆虫病原真菌，在森林生态中数量和分布仅次于球孢白僵菌(李丰伯等，2011);用于其防治小菜蛾(何劲等，2010)、茶树害虫(梁宗琦，1981)、细纹新须螨(李丰伯等，2011)、线虫(姚婷等，2006)、蚜虫(罗力等，2007)等效果很好，对二斑叶螨也有很好的毒杀效果(张晓娜等，2013)。但是，环链棒束孢是否对尼氏真绥螨安全，二者是否可以同时施用防治二斑叶螨，目前未见报道。本文从环链棒束孢17个菌株中筛选出对二斑叶螨雌成螨致死率最高的菌株，并进一步研究了其对尼氏真绥螨雌成螨的安全性，以期为环链棒束孢及其与尼氏真绥螨并用防治蔬菜二斑叶螨提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试叶螨

二斑叶螨实验种群饲养条件:紫乌芸豆Phaseolus vulgaris 植株、温度25 ±1℃、相对湿度75 ±5%、光照周期L∶D=12∶12。

尼氏真绥螨实验种群饲养条件:二斑叶螨，温度25 ±1℃、相对湿度85 ±5%、光照周期L∶D=12∶12。

1.1.2 供试菌株

供试环链棒束孢菌株均由贵州大学生命科学院真菌资源研究所提供(表1)。

1.1.3 实验器材

人工气候箱、生化培养箱、光学显微镜、体式解剖镜、培养皿 (9 cm)、塑料保鲜盒(1000 mL)、吐温-80、单手氏双管喉头喷雾器(40 mL)、移液枪(10 mL、1 mL、10μL)。

1.1.4 供试培养基

液体培养基:200 g 马铃薯，20 g 葡萄糖，1000 mL 水。将马铃薯去皮后切块煮沸0.5 h，用四层纱布过滤后放入葡萄糖，溶化后补足至1000 mL，将每100 mL 溶液分装到250 mL 三角瓶，并加入8-10 粒玻璃珠，121℃灭菌30 min。

固体培养基:200 g 马铃薯，18 g 琼脂，20 g葡萄糖，1000 mL 水。将马铃薯去皮后切块煮沸0.5 h，用四层纱布过滤后放入葡萄糖和琼脂，溶化后补足至1000 mL，121℃灭菌30 min。

表1 供试环链棒束孢菌株Table 1 Information of the Isaria cateniannulata strains

(续上表)

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

1)芽孢子悬液制备

将供试菌株接种于PDA 液体培养基，在200 r/min、27℃的摇床中培养10 d，用双层擦镜纸过滤菌悬液，获得芽孢子悬浮液。用血球计数板测定芽孢子浓度，将芽孢子液用无菌水稀释成浓度2×104、2×105、2×106、2×107、2×108个/mL的菌悬液待用。

2)分生孢子悬液制备

将供试菌株接种于PDA 培养基上，待培养基上长满菌落，用0.05%吐温-80 无菌水洗涤，并用双层擦镜纸过滤，获得孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子浓度，用0.05%吐温-80 无菌水将孢子悬液浓度制成2×104、2×105、2×106、2×107、2×108个/mL。

1.2.2 环链棒束孢菌株对二斑叶螨雌成螨的致死率测定

采用直接喷雾法，将新鲜且大小较一致芸豆叶叶周均匀涂抹灭菌白凡士林，并用无菌脱脂棉包叶柄部，每天向脱脂棉上加无菌水，放于培养皿中。选取30 头二斑叶螨雌成螨用小毫笔轻挑于叶片背面，用单手氏双管喉头喷雾器将2×107个/mL芽孢子(分生孢子)悬液喷洒0.04 mL在叶片上，到螨体上的孢子量约为6×103个，每处理4个重复。对照组用无菌水(0.05%吐温-80无菌水)处理。

1.2.3 高致死率环链棒束孢菌株对尼氏真绥螨雌成螨的存活率测定

方法同上，选取30 头尼氏真绥螨雌成螨用小毫笔轻挑于叶片背面，用单手氏双管喉头喷雾器将2× 107个/mL 13 号菌株的芽孢子悬液喷洒0.04 mL在叶片上，到螨体上的孢子量约为6×103个，之后将30 头尼氏真绥螨雌成螨单独放于如1.2.2 中的叶片背面，选取30 头二斑叶螨雌成螨放于叶片上供植绥螨取食，每处理4个重复。对照组用无菌水处理。

1.3 实验条件和观察方法

各处理从下至上依次将高2 cm的弹簧圈底座、1个培养皿置于1000 mL 内部装有100 mL 无菌水的圆筒状保鲜盒中，在27℃的培养箱中培养。每天观察二斑叶螨和植绥螨的罹病症状和记录死亡虫数，连续观察7 d。死虫移放在相同条件的培养皿中培养，镜检其产孢结构以确认其被环链棒束孢侵染。

1.4 数据处理

数据采用SPSS 17.0 软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 环链棒束孢菌株对二斑叶螨雌成螨的感染症状

2.1.1 芽孢子悬液对二斑叶螨雌成螨的感染症状

被芽孢子悬液侵染的雌成螨一般在几个小时后行动迟缓，随后停止运动，个别菌株在侵染48 h左右虫体开始变色、僵硬、浮肿甚至有菌丝体覆盖螨体现象出现。如13 号菌株处理后，2-3 d 罹病螨出现死亡且虫体逐渐被菌丝体覆盖，6-7 d开始出现产孢结构。

2.1.2 分生孢子悬液对二斑叶螨雌成螨的感染症状

雌成螨感染环链棒束孢分生孢子悬液后，一般24 h 左右出现不行动，3 d 后罹病螨虫体四肢及口部变黄、个别身体出现变色、肿胀、僵硬现象并死亡，部分菌株侵染的成螨开始出现菌丝体产孢结构。3-5 d 后，大部分菌株侵染的二斑叶螨罹病死亡虫体被菌丝体覆盖，7 d 左右显微观察可见菌丝形成的产孢结构。

2.2 不同环链棒束孢菌株对二斑叶螨雌成螨的致死中时

17 株环链棒束孢的芽孢子和分生孢子悬液对二斑叶螨雌成螨的致死率如表2。该菌17个菌株的芽孢子悬液均对二斑叶螨雌成螨表现出较高的致死率。2 号和16 号菌株的分生孢子悬液未能导致二斑叶螨死亡，其余15个菌株均使其出现不同程度的死亡率。

用SPSS17.0 软件进行数据处理，根据probit分析法，得出二斑叶螨死亡率几率值(Y)与处理时间的对数值(X)的回归直线方程和卡方值等。卡方检验的结果均小于X2(3，0.05)=7.81，P ＞0.05，表明实际观察次数与理论数值差异不显著，可以认为所得的时间回归直线与实际基本相符。芽孢子悬液对二斑叶螨相对敏感种群致死时间最短的是13 号菌株，LT50为1.47 d，其次2个菌株是10 号(2.4 d)、15 号(2.58 d);分生孢子悬液对二斑叶螨相对敏感种群致死时间最短的是17 号菌株，LT50为3.25 d，其次2个菌株是10号(4.14 d)、14 号(4.14 d)，2 号和16 号对二斑叶螨没有致死效果。相同菌株的芽孢子致死时间比分生孢子致死时间短。

表2 17 株环链棒束孢菌株对二斑叶螨致死中时间回归直线Table 2 17 Isaria cateniannulata strains for Tetranychus urticae in the death time regression straight line

(续上表)

表3 在1-5 d的17 株环链棒束孢菌株对二斑叶螨的致死个数情况Table 3 The death number of the 17 Isaria cateniannulata strains for Tetranychus urticae in 1 to 5 days

(续上表)

表4 在2-5 天的17 株环链棒束孢菌株对二斑叶螨的致死个数情况Table 4 The death number of the 17 Isaria cateniannulata strains for Tetranychus urticae in 2 to 5 days

本试验在27℃恒温，饱和湿度下，二斑叶螨在不同菌株的环链棒束孢芽孢子(分生孢子)悬液作用下，所得的结果如表3、4 所示。ANOVA 分析结果表明，相同条件下同一天不同菌株芽孢子、分生孢子对二斑叶螨的致死情况显著，相同菌悬液不同菌株之间对二斑叶螨的累积致死率呈上升的趋势，13 号菌株芽孢子悬液的死亡率3 d 达到100%，17 号菌株的分生孢子悬液5 d的累积死亡率最高达78.33%，2、16 号菌株的分生孢子没有致死率，可见13 号环链棒束孢芽孢子的致死率最高。

2.3 5 种浓度的13 号环链棒束孢菌株芽孢子对尼氏真绥螨存活率的影响

结果(表5)表明，环链棒束孢芽孢子液的的浓度低于2×106个/mL 时，处理与对照对尼氏真绥螨的存活率没有明显差异，而当浓度高于2×107个/mL，随着时间、浓度的增加，存活率下降，但其存活率均高于80%，浓度为2×108个/mL 时，螨体第6 天才出现死亡现象，且存活率在7 d 时为80.85%。结果(表6)表明，环链棒束孢分生孢子液的的浓度低于2×106个/mL 时，处理与对照对尼氏真绥螨的存活率均为100%，而当浓度高于2×107个/mL，随着时间、浓度的增加，存活率下降，但其存活率均高于70%，浓度为2×108个/mL 时，螨体第4 天才出现死亡现象，且存活率在7 d 时为70.75%。

表5 5 种浓度的13 号环链棒束孢芽孢子对尼氏真绥螨的存活率影响(%，Mean±SE)Table 5 Effects of the five concentrations of No.13 Isaria cateniannulata strains on survival rate (%)of Euseius nicholsi

表6 5 种浓度的17 号环链棒束孢分生孢子对尼氏真绥螨的存活率影响(%，Mean±SE)Table 6 Effects of the five concentrations of No.17 Isaria cateniannulata strains on survival rate (%)of Euseius nicholsi

3 结论与讨论

本试验的数据可知，同一菌株对二斑叶螨的侵染率随着时间的增加而增加;不同地区不同寄主的环链棒束孢的芽孢子和分生孢子对二斑叶螨雌成螨表现出不同程度的致死率;分生孢子中除两株(2 号、16 号)外，其他菌株对螨均有致死现象，其中13 号环链棒束孢菌株的芽孢子和17 号菌株的分生孢子表现出时间短、致死率高的特点。本文中的数据还显示，低于2× 107个/mL 时，13 号菌株的芽孢子和17 号菌株的分生孢子对二斑叶螨雌成螨的存活率没有明显的负面影响。结合上述试验结果可知，本文筛选杀二斑叶螨致死率较高而对尼氏真绥螨影响较小的环链棒束孢菌株为13 号菌株的芽孢子悬液和17 号菌株的芽孢子液，最适浓度为2×107个/mL。

虫生棒束孢属对害虫防治有相当大的潜力，已知绿僵菌对二斑叶螨有较强的致病性(徐美娟和宋勇义，2012)，环链棒束孢对小菜蛾的致死率也较高(韩艳峰等，2008)，本实验中环链棒束孢对二斑叶螨的致病性比绿僵菌效果好，说明环链棒束孢在害虫生物防治中的应用价值值得进一步开发利用。

环链棒束孢作为一种新型杀螨剂对二斑叶螨的效果较好，同一菌株对二斑叶螨的侵染效果随时间的增加而增加(张晓娜等，2013)，本文所用的17 株环链棒束孢侵染试验显示的结果表明多数菌株对二斑叶螨侵染率较高且侵染效果和时间成正相关，这与其防治菜青虫等害虫效果一致(刘爱英等，1982)。

昆虫病原真菌对昆虫的致病性与本身的遗传特性密切相关，其中产孢质和量对昆虫的致病性有很大的关系，研究发现环链棒束孢不同菌株的产孢量大小对小菜蛾的致病性呈现一定的相关性(韩艳峰等，2008)，室内测定一株绿僵菌对苹果二斑叶螨雌成螨的致病力，发现致病力的强弱与接种孢子浓度密切相关 (徐美娟和宋勇义，2012)，本文中不同菌株对二斑叶螨的致死率不同可能与不同菌株之间的产孢量不同相关，需进一步实验验证。研究发现环链棒束孢不同菌株对小菜蛾致病性与地理来源和寄主种类之间无明显相关性(韩燕峰等，2008)，本文中17 株不同地区不同寄主的环链棒束孢对二斑叶螨的致死率试验结果也表明，不同菌株之间无明显的相关性。

虫生真菌对寄主的致病性存在差异是由于芽孢子、分生孢子、菌丝体等表面的碳水化合物不同所致，研究发现白僵菌和寄主昆虫之间的相互关系是通过虫生真菌表面的碳水化合物抗原的粘附、异己分子识别和对寄主免疫入侵反应过程中的不同作用而表现出不同的致病性，分生孢子和芽孢子细胞表面的粘附性不同，后者的亲水性表面的结合性比前者强(Wanchoo et al.，2009)，本文中不同地区、不同寄主的菌株之间的致死率差异较大，芽孢子的致死率明显高于分生孢子，也很好的验证了这一点。

虫生真菌对植绥螨没有致病影响 (Wekesa et al.，2007)，用白僵菌处理巴氏钝绥螨后捕食螨的发育历期、雌雄满寿命和每雌每天的产卵量与都照差异不显著(王静等，2011);白僵菌处理胡瓜新小绥螨发现其对捕食螨的影响甚微(张艳璇等，2013)。在此基础上，本文用环链棒束孢对尼氏真绥螨进行评价，发现防治二斑叶螨的高效环链棒束孢菌株对尼氏真绥螨的存活率也没有明显的负面效应，因此环链棒束孢和尼氏真绥螨可以同时应用。

本试验均在室内可控的环境下进行，且采用的条件均有利于菌体的生长，野外开放的环境下，该生防真菌对捕食螨的长期影响有待进一步的田间试验来验证。该研究结果对开展利用虫生真菌生物防治二斑叶螨、菌螨协同控制等方面有重要的指导意义。

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