刺桐姬小蜂成瘿过程中虫瘿内几种酶的活性变化

汪少妃，袁 毅，刘建强，朱 麟

(海南师范大学生命科学学院，海南省动植物生态学省部共建实验室，海口 571158)

刺桐姬小蜂Quadrastichus erythrinae Kim 隶属膜翅目Hymenoptera，姬小蜂科Eulophidae，啮小蜂亚科Tetrastichinae，胯姬小蜂属Quadrastichus，是2004年新发现的一种检疫性入侵害虫(焦 懿等，2006)。主要分布在毛里求斯、留尼汪、新加坡(Kim et al.，2004)、中国台湾(Yang，2004)和中国广东省的深圳与广州、福建省的厦门、海南省的三亚与万宁等地(黄蓬英等，2005)。刺桐姬小蜂是一种重要的致瘿害虫，专一为害刺桐属Erythrina spp.的植物。成虫喜欢在刺桐的嫩枝、幼嫰的叶柄和叶片上产卵并诱导植物形成虫瘿，卵、幼虫及蛹的发育均在虫瘿内完成(陈志麟等，2006)。虫瘿是由造瘿昆虫产卵或幼虫取食时一些分泌物的刺激后，而造成植物细胞加速分裂和异常分化形成的畸形瘤状物或突起 (Stone and Schonrogge，2003)。虫瘿的发育可分为初始形成期、成长分化期、成熟期和开裂期4个阶段(Lalonde and Shorthouse，1984)。虫瘿形成过程中会导致植物产生一系列的生理生化反应(杨曼妙，2007)，导致营养物质和次生物质含量改变，及保护酶活性变化(朱麟和古德祥，1999)。由于刺桐姬小蜂是近年入侵我国的检疫性害虫，国内研究主要集中在生物学特性和危害防治方面(Kim et al.，2004;Yang，2004;黄蓬英等，2005;杨伟东等，2005;陈志麟等，2006;焦懿等，2006;杨义标等，2006;耿晓红，2008)，关于刺桐姬小蜂危害后，寄主叶片生理变化未见报道。本文对刺桐姬小蜂为害形成虫瘿四个不同阶段的保护酶活性进行了测定，分析了虫瘿不同阶段保护酶活性变化规律，探讨寄主植物对刺桐姬小蜂虫瘿形成产生的抗性反应，研究结果对于探讨虫瘿形成机制具有较重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料来源

供试的寄主为盆栽的刺桐扦插苗，株高约50 cm，共计70 株。供试虫源为刺桐姬小蜂，于海南省海口市采集刺桐姬小蜂危害的刺桐枝条，带回实验室待其羽化后接种。

1.2 方法

1.2.1 接种方法

1.2.2 酶活性测定

超氧化物歧化酶 (SOD)和过氧化氢酶(CAT)测定使用相关试剂盒，过氧化物酶(POD)的活性采用愈创木酚比色法测定(孔祥生和易现峰，2008)，多酚氧化酶(PPO)活性的测定采用比色法(纪淑娟等，2010)。对待测样品进行相同的前期处理，准确称取0.2 g 待测叶片，按重量体积比9 倍生理盐水冰浴下匀浆，制成10%的匀浆液，3000 r/min，离心10 min，取上清液进行测定，酶液提取平行3 次，重复2 次。

SOD 活性测定:取对照管和测定管中分别加入双蒸水、酶液和相关试剂，用漩涡混匀器混匀，置37℃水浴40 min 再加入显色剂，双蒸水调零，于波长550 nm 处比色，测OD 值，计算SOD 活性以U/mg prot为单位。

CAT 活性测定:按照CAT 试剂盒说明书规定先后在对照管和测定管中添加试剂和酶液，于405 nm处比色，测定各管OD 值，计算CAT 活性。

POD 活性测定:以愈创木酚为H2O2酶的底物，加入酶液，在470 nm 处测OD 值，以每分钟吸光度变化0.01为1个POD 活性单位。

PPO 活性测定:取0.1 mol/L 邻苯二酚1 mL加入4 mL pH6.1的磷酸缓冲液中，加入0.1 mL的酶液，于420 nm 处测定吸光度变化，每隔20 s 测一次，共测2 min。以每分钟吸光度变化0.01为1个PPO 活性单位。

1.2.3 统计方法

采用SPSS16.0 for Windows 软件计算原始数据的平均值和标准差，进行组间均值数据的One-Way ANOVA 方差分析，采用LSD 多重比较。

2 结果与分析

2.1 SOD 活性影响

由图1 可知，对照组中SOD 活性随发育表现逐渐减低，非虫瘿组织和虫瘿组织中SOD 活性呈上升、下降再上升的趋势，从成长分化期开始随受害程度加重虫瘿组织SOD 活性明显高于对照组和非虫瘿组织，达到差异极显著水平(P＜0.01)，特别是在开裂期是对照组的5.36 倍;在成熟期虫瘿组织和非虫瘿组织SOD 活性均明显下降(P＜0.01);而非虫瘿组织相比对照无明显变化，说明刺桐姬小蜂为害主要诱导虫瘿部位SOD 酶活性变化，对非虫瘿部位影响相对较小。

2.2 CAT 活性影响

CAT 酶活性变化趋势(图2)与SOD 相似，虫瘿组织中酶活性均高于对照组，且达到差异极显著(P＜0.01)，在成熟期增加达到14.23倍;非虫瘿组织中CAT 活性先上升后下降，成长分化期为对照组的8.77 倍，达到差异极显著(P＜0.01)，到成熟期CAT 活性有所下降，但仍显著高于对照组(P＜0.05)。与SOD 酶活变化相似，CAT 活性的增加也主要体现在虫瘿组织中。

图1 刺桐姬小蜂诱导的虫瘿不同发育阶段SOD 活性Fig.1 The SOD activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

图2 刺桐姬小蜂诱导的虫瘿不同发育阶段CAT 活性Fig.2 The CAT activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

2.3 POD 活性影响

从图3 可以看出，相比对照组POD 酶活性增加主要体现在非虫瘿组织上，且每个时期和对照相比显著增加(P＜0.01);到开裂期为对照的2.16 倍;虽然虫瘿组织中POD 酶活性呈上升趋势，但在前三个时期均显著低于对照组(P＜0.05);而在开裂期虫瘿中的酶活为对照组2.66 倍，与非虫瘿组织比也达到差异极显著水平(P＜0.01)。

2.4 PPO 活性影响

多酚氧化酶(PPO)可氧化酚类化合物，同时也是木质素的合成前体(毛爱军，2003)，为植物抗性的重要酶指标。由图4 可知，除初始形成期外，虫瘿组织和非虫瘿组织中的PPO 活性均比对照组要高，虫瘿组织中的酶活随发育逐渐上升，到开裂期为对照的19.73 倍;各时期相比对照组和非虫瘿组织的PPO 酶活性均达到差异极显著水平(P＜0.01);而成熟期非虫瘿组织比对照升高不显著(P ＞0.05)。所以，在虫瘿的不同发育阶段PPO 酶活性主要体现在虫瘿组织中。

图3 刺桐姬小蜂诱导的虫瘿不同发育阶段POD 活性Fig.3 The POD activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

图4 刺桐姬小蜂诱导的虫瘿不同发育阶段PPO 活性Fig.4 The PPO activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

3 结论与讨论

正常情况下，细胞内的活性氧含量与保护酶系统之间处于动态平衡状态(Prasad，1996)，一旦植物受到逆境胁迫，正常的氧代谢受阻，使得植物体内的活性氧含量会迅速积累，加速了膜脂过氧化作用从而导致膜系统受损，引起细胞膜的通透性增加及电解质的渗漏，最终会导致细胞死亡和组织被损坏，使得植物处于一种损伤状态(Havlickova et al.，1996;程璐，2009)，而SOD、CAT、POD 和PPO 是细胞内防御系统中重要的保护酶。本试验研究表明，受刺桐姬小蜂危害后受害叶片内保护酶(SOD、CAT、POD、PPO)活性显著提高，说明刺桐姬小蜂虫瘿的形成诱导刺桐的保护酶产生，表现出了明显的防御反应。

SOD的主要作用是清除O-2，同时产生歧化性产物H2O2;而CAT 在保护酶系中主要起到降解H2O2的作用(Prasad，1996)，能有效地阻止O-2和H2O2在植物体内的积累，防止自由基对细胞的毒害(张庭伟和刘长仲，2011)。本次试验结构发现:SOD 和CAT 活性变化主要表现在虫瘿组织中;刺桐姬小蜂的刺激，导致植物体内O-2大量产生，使得虫瘿中SOD 活性迅速上升，到成熟期，由于刺桐姬小蜂化蛹取食活动的停止酶活性有所下降;CAT 主要还原SOD 作用的产物，所以其活性变化的趋势和机理与SOD 相似。说明刺桐姬小蜂的取食活动与寄主植物生理生化变化相关。

POD 和PPO 可通过参与木质素的合成和细胞壁蛋白的交联化作用来促进细胞壁进一步加厚，可以有效的防治其他生物的捕食和入侵(Gaspar et al.，1982;Macadam et al.，1992;Lamb and Dixon，1997;Allison and Schultz，2005;卫麦霞等，2008)。测试结果发现，PPO 活性在整个虫瘿发育阶段呈上升趋势，初期增加较缓，随后逐步高于对照;PPO 作用提高了虫瘿组织的木质化程度，对生活在虫瘿内的虫体起到一定的保护作用，与(王召元，2007;王洪涛，2011;吕文玲，2012)研究结果相似。而POD 活性在虫瘿组织中明显比对照要低，这是刺桐抗虫性较低的生理生化机制之一，也是造瘿昆虫与寄主植物协同进化的结果，这与李诺等(2010)对桉树枝瘿姬小蜂虫瘿研究结果一致。非虫瘿部分PPO 和POD 活性都显著高于对照，可能是寄主通过增加虫瘿周围组织细胞壁的厚度，来防止刺桐姬小蜂在叶片上的再次产卵，也是植物的一种自我保护作用。

本研究仅对刺桐姬小蜂危害后，刺桐叶片中不同时期这四种保护酶的变化。这些酶活性与刺桐姬小蜂的取食活动有关，同时也表现出了寄主植物的抗性作用。但对于植物整体防御机制可能还涉及到其他生理生化反应及分子水平上的调控机制等方面，仍需有待进一步研究。

References)

Allison SD，Schultz JC.Biochemical responses of chestnut oak to a galling cynipid ［J］.Journal of Chemical Ecology，2005，31(1):151-166.

Chen L.Studies on anti-aphis mechanism of alfalfa's biochemical indexes ［D］.Master Dissertation.Gansu:Gansu Agriculture University.2009，1-37.［程璐.苜蓿生理生化抗蚜机制初步研究［D］.硕士论文.甘肃:甘肃农业大学.2009，1-37］

Chen ZL，Yu DJ，Shao ZF，et al.Occurrence of erythrina gall wasp，Quadrastichus，and the prosess of the fall shaped ［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2006，43 (6):863-866.［陈志麟，余道坚，邵志芳，等.刺桐姬小蜂发生习性及其虫瘿形成分析［J］.昆虫知识，2006，43 (6):863-866］

Gaspar T，Penel CL，Thorpe T，et al.A Survey of their Biochemical and Physiological Roles in Higher Plants［M］.Geneva，University of Geneva，1982.

Geng XH.Bionomics and ecology of theerythrinae gall wasp，Quadristichus erythrinae Kim［D］.Master Dissertation.Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University.2008，1-50.［耿晓红.刺桐姬小蜂生物学和生态学特性的研究［D］.硕士论文.福州:福建农林大学.2008，1-50］

Havlickova H，Cvikrova M，Eder J.Changes in the pattern of phenolic acids induced by aphid infest at ion in two winter wheat cultivars［J］.Bullet in OILB-SROP，1996，19 (5):106-110.

Huang PY，Fang YW，Huang J，et al.A new invasive alien species，Quadrastchus erythrinae，in mainland of China ［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2005，42 (6):731-732.［黄蓬英，方元炜，黄建，等.中国大陆一新外来入侵种一刺桐姬小蜂［J］.昆虫知识，2005，42 (6):31-732］

Ji SJ，Yin JN，Li JZ.Properties and measurement of polyenol oxidase in flesh of Miyou pomelo fruits ［J］.Northern Horticulture，2010，(17):171-174.［纪淑娟，尹竞男，李家政.蜜柚多酚氧化酶的酶学特性与活性测定研究［J］.北方园艺，2010，(17):171-174］

Jiao Y，Chen ZL，Yu DJ，et al.A new record genus and new record species of Eulophidae (Hymenoptera)in continental China［J］.Entomotaxonomia，2006，28 (1):69-74.［焦懿，陈志麟，余道坚，等.姬小蜂科中国大陆一新记录属一新记录种［J］.昆虫分类学报，2006，28 (1):69-74］

Kim IK，Delvare G，La SJ.A new species of Quadrastichus(Hymenoptera:Eulophidae):A gall-inducing pest on Erythrina spp.(Fabaceae)［J］.J.Hym.Res.，2004，13 (2):243-249.

Kong XS，Yi XF.Experiment Technology of Plant Physiology ［M］.Beijing:China Agricultural Scientech Press，2008.［孔祥生，易现峰.植物生理学实验技术［M］.北京:中国农业出版社，2008］

Lalonde RG，Shorthouse JD.Developmental morphology of the gall of Urophora cardui (Diptera，Tephritidae)in the stems of Canada thistle (Cirsium arvense)［J］.Can.J Bot.，1984，62:1372-1384.

Lamb C，Dixon RA.The oxidative burst in plant disease resistance［J］.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，1997，48:251-275.

Li N，Wang MY，Luo JT，et al.Preliminary study on physiology and biochemistry characteristics of eucalyptus galls caused by Leptocybeinvasa［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2010，38 (8):4126-4127.［李诺，王美英，罗基同，等.桉树枝瘿姬小蜂虫瘿生理生化初步研究［J］.安徽农业科学，2010，38 (8):4126-4127］

Lv WL.Biological charzcteristics of Pseudophacopteron alstonium and its effects on the physiological and biochemical characteristics of the host plant ［D］.Master Dissertation.Guangxi:Guangxi University.2012，1-69.［吕文玲.鸭脚木星室木虱生物学特性及其对寄主生理生化的影响［D］.硕士论文.广西:广西大学.2012，1-69］

Macadam JW，Nelson CJ，Sharp RE.Peroxidase activity in the leaf elongation zone of tall fescue ［J］.Plant Physiol.，1992，99:872-878.

Mao AJ，Wang YJ，Feng LX，et al.Variation of polyphenoloxidase，peroxidase and phenylalanine ammonialyasa in hot pepper seedings infected by Phytophthora capsici L.［J］.Acta Agriculturae Boreali-Sinica，2003，18 (12):66-69.［毛爱军，王永健，冯兰香，等.疫病病菌侵染后辣椒幼苗体内保护酶活性的变化［J］.华北农学报，2003，18 (12):66-69］

Prasad TK.Mechanism of chilling-induced oxidative stress injury and tolerances in developing maize seedlings:changes in ant ioxidant system，oxidation of proteins and lipids and protease activities［J］.Plant Journal，1996，10 (6):1017-1026.

Stone GN，Schonrogge K.The adaptive significance of insect gall morphology［J］.Ecology and Evolution，2003，18 (10):512-522.

Wang HT.Effects of tobacco plants infested by Bemisia tabaci(Gennadius)B-biotype on the development and reproduction of Spodoptera litura (Fabricius)and its mechanism ［D］.Ph.D.dissertation.Shandong:Shandong Agricultural University.2011，1-95.［王洪涛.B 型烟粉虱取食诱导的烟草对斜纹夜蛾生长发育和繁殖的影响及机制［D］.博士论文.山东:山东农业大学.2011，1-95］

Wang SY.Study on physiological and biochemical basis of burl forming after inoculation with Agrobacterium tumefaciens into Populus tomentosa［D］.Master Dissertation.Hebei:Hebei Agricultural University.2007，1-36.［王召元.毛白杨接种根瘤农杆菌后瘿木形成的生理生化基础研究［D］.河北.河北农业大学.2007，1-36］

Wei MX，Gong DX，Li DJ，et al.Effect of Prochloraz，its formulation and major metabolites on the activities of SOD and POD in Lemna paucicostata ［J］.Journal of Agro-Environment Science，2008，27 (3):1072-1076.［卫麦霞，龚道新，黎定军，等.咪鲜胺及其制剂和主要代谢物对三叶浮萍SOD 和POD 活性的影响［J］.农业环境科学学报，2008，27 (3):1072-1076］

Wu YH，Zhong LJ，Zhao XX.Relaionship among totalphenol，flavonoid and PPO activity with the necrosis of tobacco infected by PVYN［J］.Acta Pheytopa Thologica Sinica，2007，37 (4):398-402.［吴元华，钟丽娟，赵秀香.烟草感染PVYN 后叶脉坏死与总酚、类黄酮及PPO 关系研究［J］.植物病理学报，2007，37 (4):398-402］

Yang MM.Gall—Insects and plants to dance ［J］.Scientific Development，2007，409:29-33.［杨曼妙.虫瘿——昆虫与植物共舞［J］.科学发展，2007，409:29-33］

Yang MM，Tung GS，La SJ.Outbreak of Erythrina gall wasp(Hymenoptera:Eulophidae)on Erythrina spp.(Fabaceae)in Taiwan［J］.Plant Protection Bulletin，2004，46 (4):391-396.

Yang WD，Yu DJ，Jiao Y，et al.Occurrence，damage and quarantine of the erythrinae gall wasp［J］.Plant Protection，2005，31 (6):36-38.［杨伟东，余道坚，焦懿，等.刺桐姬小蜂的发生、危害与检疫［J］.植物保护，2005，31 (6):36-38］

Yang YB，Shao ZF，Qiu SS，et al.Occurrence and damage of the erythrinae gall wasp in Shenzhen［J］.Plant Quarantne，2006，20(6):356-357.［杨义标，邵志芳，邱少松，等.深圳刺桐姬小蜂的发生与为害［J］.植物检疫，2006，20 (6):356-357］

Zhang TW，Liu CZ.Influences of Rhopalosiphum padi on oxidases of three wheat seeding［J］.Plant Protection，2011，37 (4):72-75.［张庭伟，刘长仲.禾谷缢管蚜对三个小麦品种幼苗保护酶的影响［J］.植物保护，2011，37 (4):72-75］

Zhu L，Gu DX.The contemporary implication of the concept of insect resistance of plants ［J］.Entomological Knowledge，1999，36(6):355-360.［朱麟，古德祥.植物抗虫性概念的当代内涵［J］.昆虫知识，1999，36 (6):355-360］