温度胁迫对荒漠昆虫小胸鳖甲(鞘翅目:拟步甲科)幼虫热激蛋白基因hsp70 表达的影响

石 萌，刘晓静，刘小宁，马 纪

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)

热激蛋白(Heat shock proteins，HSP)是生物响应环境胁迫时体内合成的一类蛋白质(Lindquist，1986)，许多环境因素的胁迫都会诱导生物体内产生HSP，如温度、干燥、金属离子、病原体等(Zhao and Jones，2012)。根据序列同源性及分子量大小可将HSP 分为不同的家族，主要包括 HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 及 sHSP(Feder and Hofmann，1999)，其中HSP70 最为保守，研究得最为广泛。HSP70 家族由两种不同的基因编码，一种是组成型的hsc70，一种是诱导型的hsp70，这两种基因都编码在细胞中作为分子伴侣发挥重要作用的蛋白质(Gething and Sambrook，1992)。

昆虫在应对高温刺激时，HSP的热激响应非常显著与普遍。例如，用高温预处理南美斑潜蝇Liriomyza huidobrensis 可显著增加hsp70 和hsp20 基因的表达并提高其耐热性(Huang et al.，2007)。不同发育阶段的赤拟谷盗Tribolium castaneum 在40℃处理1 h 后，hsp70 I 基因的转录水平比对照增加了1.1-2.0 倍(Mahroof et al.，2005)。42℃处理荒漠甲虫谢氏宽漠王Mantichorula semenowi Reitter 1 h后hsp70 表达至最高峰(唐婷等，2008)。

昆虫应对低温刺激时，不同物种HSP的响应方式有较大差异。滞育期越冬昆虫的HSP 普遍存在上调现象，并被认为是提高滞育期昆虫耐寒性的主要因素(Rinehart et al.，2007)。HSP 对低温诱导的响应温度可以确定两种斑潜蝇的地理分布界限，耐寒性强的南美斑潜蝇的最低诱导温度比更耐热的美洲斑潜蝇Liriomyza sativae 要低2℃(Huang and Kang，2007)。在-7℃处理果蝇Drosophila melanogaster 1 h 室温恢复30 min 后，hsp70的相对表达量显著上升，存活率也显著高于对照(Udaka et al.，2010)。荒漠昆虫光滑鳖甲Anatolica polita 在-5℃胁迫10 min 并在室温恢复15 min 后hsp70的表达量显著升高 (陈亮等，2007)。

在有些昆虫中HSP 也参与发育过程。赤拟谷盗的hsp90 基因与复眼发育有关 (Knorr and Vilcinskas，2011)。黑腹果蝇雄性配子形成及胚胎发育期有sHSP的表达 (Joanisse et al.，1998)。烟草天蛾Manduca sexta (Rybczynski and Gilbert，2000)、摇蚊Chironomus (Karouna-Renier et al.，2003)的hsp70 基因表达受发育调节等。Mahroof等(2005)发现赤拟谷盗hsp70 基因在小龄幼虫和成虫中表达水平显著高于老龄幼虫和蛹，且经热激后，小龄幼虫和成虫hsp70 受到诱导，而老龄幼虫和蛹却受到抑制，表明不同HSP 对于昆虫发育及响应环境胁迫具有重要作用。

在HSP 超家族中，HSP70 对环境因子胁迫最为敏感，hsp70 基因普遍上调表达(Reuner et al.，2010;Aruda et al.，2011;Guo et al.，2012)。40℃高温处理棉铃虫Helicoverpa zea 30 min 后，其hsp70和hsp90 基因表达均受到热诱导，且hsp70 相比hsp90 更加强烈(Zhang and Denlinger，2010)。冷处理黑腹果蝇Drosophila melanogaster 后，多种hsp基因都上调表达，但hsp70 基因对冷胁迫响应最强烈，其相对表达量在冷胁迫及恢复期间均显著上调(Colinet et al.，2010)。甜菜夜蛾Spodoptera exigua 中，hsp70 对高温和低温的响应程度比hsp90更强烈，且hsp90 和hsp70 对温度的响应程度因发育阶段的不同而变化，表明除了热激响应外，它们可能还参与昆虫的发育(Jiang et al.，2012)。此外，我们前期研究也发现小胸鳖甲Microdera punctipennis 成虫在42℃处理1 h 后hsp70 受到强烈诱导，可达对照的400 倍 (马文静和马纪，2012)。基于昆虫中hsp70 基因表达对温度胁迫响应的普遍性及强烈程度，本研究对小胸鳖甲幼虫hsp70 基因在不同发育阶段及温度胁迫下的表达模式进行研究。

拟步甲科昆虫是干旱荒漠区的主要生物类群，小胸鳖甲是古尔班通古特沙漠的拟步甲科特有种(黄人鑫等，2005)，其幼虫共有7个龄期，在30℃的总历期为56 d，整个发育阶段均生活在浅层沙土中(Wang et al.，2011)。其中1 龄幼虫历期为3 d，期间幼虫基本不进食，直接蜕皮成为2 龄幼虫，进入2 龄时体重几乎不变，由于1 龄幼虫体内积累了大量的营养物质，如糖原等，因此相比其它龄期，1 龄幼虫具有最低的过冷却点(刘晓静等，2012);从2-3 龄开始体重迅速增加，但体重基数很小;4 龄是小龄与大龄幼虫之间的过渡期，其增长速率低于其他龄期的幼虫，推测其体内各类物质的合成正处于准备阶段，此时体内含水量最高;而5-7 龄幼虫体重的增加则进入迅猛发展期，其中7 龄幼虫表皮较厚，含水量较低。由于HSP 具有抗细胞凋亡和抗氧化等功能，并能通过防止蛋白质变性来保护细胞，从而提高了细胞对温度胁迫或伤害的耐受性，因此热激蛋白在昆虫对环境的适应过程中发挥作用，研究小胸鳖甲幼虫的hsp70 基因在不同温度下的表达变化将有助于了解其对荒漠环境的适应机制。在不同生物中热激蛋白参与逆境胁迫响应的方式有较大不同(Feder and Hofmann，1999;Huang et al.，2009;Gross et al.，2009;Karl et al.，2009)，然而对耐干旱抗低温的荒漠拟步甲科昆虫的相关研究却非常有限。本文在前期对小胸鳖甲成虫hsp70 克隆表达的基础上(马文静和马纪，2012)，研究了小胸鳖甲幼虫在发育过程中以及高低温对幼虫hsp70 表达的影响，结合幼虫在低温条件下的耐寒性，从分子伴侣的角度对荒漠昆虫的环境适应性进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源

实验所用小胸鳖甲各龄期幼虫均饲养于30℃恒温培养箱(光周期为16L∶8D)中，并根据幼虫的发育历期、体重、体长和头壳宽度，来判定幼虫龄期(Wang et al.，2011)。

1.1.2 主要试剂

SYBR Green Supermix kit、Trizol 试剂购 自Invitrogen 公司，Taq 酶、DNase I、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、Oligo (dT)、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)、DNA Marker、pMD18-T均购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)，SanPrep 柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒及DEPC 购自上海生工生物工程股份有限公司，大肠杆菌DH 5α菌株为本实验室保藏菌种，其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 小胸鳖甲幼虫的温度处理及存活率统计

选取1-7 龄大小均匀的小胸鳖甲幼虫置于培养皿中，分别于42℃、5℃和10℃恒温培养箱中处理1、3、5、7 h，以正常饲养的幼虫作为对照，即0 h 处理。每个处理设置3个平行组，其中每组1-2 龄100 头，3 龄30 头，4 龄10 头，5 龄3 头，6-7 龄2 头。

选取1、4、7 龄大小均匀的小胸鳖甲幼虫置于培养皿中，分别于5℃和10℃低温培养箱中处理2 h 后直接转置于-10℃处理1 h 后统计存活率，以正常饲养的幼虫于-10℃处理1 h为对照，每个处理设置3个平行组，每组20 头幼虫。

1.2.2 小胸鳖甲幼虫总RNA的提取和cDNA 合成

将试虫置于装有液氮的研钵中研磨成粉末，用不锈钢匙把粉末转加于1 mL的Trizol 裂解液中，振荡混匀，使细胞充分裂解，然后以200μL 氯仿进行抽提，再加入等体积异丙醇沉淀，然后用无水乙醇及75%乙醇分别洗涤后晾干，加入DNase I消化反应液溶解沉淀，于37℃水浴锅中消化30 min，再分别用氯仿抽提，异丙醇沉淀及75%乙醇洗涤，将RNA 沉淀室温干燥后，溶于DEPC处理水中，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用NanoDrop ND-1000 分光光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington，USA)检测RNA的浓度和纯度。cDNA的合成以1μg 总RNA为模板，反转录用Oligo (dT)作下游引物，70℃保温10 min 后迅速于冰上冰镇2 min 以上。用MLV 反转录酶进行反转录反应，42℃保温1 h，70℃保温15 min 后冰上冷却，将反转录产物cDNA 置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR 引物、标准质粒及反应程序

根据小胸鳖甲hsp70 全长基因的cDNA 序列(GenBank 登录号为JF421286)，利用Primer 5.0软件设计荧光定量PCR 引物。其中目的基因hsp70及内参基因β-actin 核心片段的扩增长度分别为118 bp 和 120 bp。hsp70 引物序列为 hspF:AAGAACGACAAGGGCAGACTG，hspR:CCTTCTA ATTGATTCCTAGCCGCT;β-actin 引物序列为actinF:TACTCCGTATGGATCGGTGGATC，actinR:TTAGAAGCACTTGCGGTGGAC。

为构建检测目的基因mRNA 表达水平差异的标准品，以cDNA为模板，PCR 扩增目的基因相应片段，构建pMD18-T 重组质粒，经上海生工生物工程股份有限公司测序验证，并使用SanPrep柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒提取重组质粒。对制备的重组质粒溶液，用紫外分光光度计测定OD260/280 以分析纯度，并记录原始浓度，储存于-80℃冰箱备用。将标准品用DEPC 处理水按10 倍梯度稀释，用作荧光定量PCR 标准曲线。

实时荧光定量PCR 反应按带有ROX的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG的使用说明进行。取等量cDNA 进行PCR 反应，每个样品重复3 次。于GeneAmp Thermal Cycler 7500 中进行实时荧光定量PCR 反应，程序为:50℃2 min;95℃2 min;95℃15 s，58℃30 s，72℃30 s，40个循环。

1.2.4 数据分析

基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCT法。本实验以小胸鳖甲β-actin 基因作为内参基因，Hou 等(2010)研究表明小胸鳖甲β-actin 在-7℃、4℃、30℃和45℃胁迫2 h 以及常温饲养的实验组中具有恒定的表达量，其mRNA的转录水平无显著性差异，表明小胸鳖甲β-actin 可作为外界环境胁迫作用下基因转录水平高低的内参基因。hsp70 基因表达量是与内参基因相比的相对表达量，并以未处理的对照组进行归一化处理，在比较各龄幼虫hsp70的表达时，以1 龄做归一化。采用医学生物统计学软件GraphPad Prism 4.0 中的单因素方差分析和Turkey 多重比较分析数据。

2 结果与分析

2.1 小胸鳖甲幼虫的总RNA

用不同温度处理小胸鳖甲幼虫后，提取总RNA 进行凝胶电泳检测，获得了条带完整清晰的总RNA，并具有昆虫总RNA 所特有的18S的亮度是28S的两倍以上的特征，紫外分光光度计检测表明OD260/280 值均在1.9-2.1 之间，纯度较好，可用于后续实验。

2.2 小胸鳖甲hsp70 基因及内参基因的标准曲线

在实时定量PCR 中，小胸鳖甲β-actin (内参基因)及热激蛋白基因hsp70的熔解曲线较好，无杂峰出现，扩增产物单一，且阴性对照无扩增曲线。两个基因的线性标准曲线R2分别为0.996和0.997，可在较宽范围内用于小胸鳖甲hsp70 基因相对表达量的检测。

2.3 小胸鳖甲幼虫hsp70 基因的发育阶段性表达

在室温条件下，小胸鳖甲各龄幼虫hsp70 mRNA的基础水平有较大差异，以1 龄幼虫的表达量为标准，变化规律是:大龄(6-7 龄) ＞小龄(1-2 龄) ＞中龄(3-5 龄) (图1)，其中在5 龄最低，只有1 龄的39.3%，在3 龄只有1 龄的58.8%。而在大龄幼虫(6-7 龄)中则显著升高，其中6 龄的表达量最高，为1 龄的5.4 倍(P＜0.05)，6 龄与7 龄之间无显著差异，表明小胸鳖甲hsp70的mRNA 水平受发育阶段影响。HSP70的功能不仅是应激，可能还在幼虫发育过程中发挥作用。

图1 小胸鳖甲各龄幼虫hsp70的mRNA 相对水平Fig.1 Relative mRNA levels of hsp70 from Microdera punctipennis larvae

2.4 高温胁迫对小胸鳖甲幼虫hsp70 基因表达的影响

小胸鳖甲各龄期幼虫经42℃高温胁迫后，hsp70 基因的相对表达量都极显著地高于对照(图2)，在高温处理1 h 时表达量达到最高，其中3-5 龄幼虫hsp70的上调表达倍数分别为对照组的2666.8、1596.4 和5290.7 倍，大龄幼虫 (6-7 龄)达到对照的137.2 和131.1 倍，而小龄幼虫(1-2 龄)则分别是对照组的5.2 和777.4 倍，之后都有不同程度的下降。上述结果表明除1 龄外，各龄幼虫对高温胁迫能做出迅速响应，大量合成HSP 进行应激处理。1 龄幼虫的热应激响应程度最弱，并且在42℃胁迫3 h 后hsp70 mRNA 相对水平才达到最高，为对照的12.1 倍左右。

比较小胸鳖甲各龄幼虫的本底hsp70 水平与热应激响应的程度，可发现其间有高度的负相关，相关系数为-0.69，即hsp70的本底水平越低，对热应激的响应程度越高。表明HSP70 在小胸鳖甲幼虫应对高温胁迫中发挥重要作用。

图2 小胸鳖甲各龄幼虫42℃胁迫0、1、3、5、7 h 后hsp70的mRNA 相对水平Fig.2 Relative mRNA levels of hsp70 from Microdera punctipennis larvae stressed at 42℃for 0，1，3，5，7 h，respectively

2.5 低温处理对小胸鳖甲幼虫hsp70 基因表达的影响

图3 小胸鳖甲各龄幼虫低温处理1、3、5、7 h 后hsp70的mRNA 相对表达水平Fig.3 Relative mRNA levels of hsp70 from Microdera punctipennis larvae treated at 5℃ (A)and 10℃ (B)for 1，3，5，7 h，respectively

前期对小胸鳖甲生活习性的观察发现，小胸鳖甲喜温避光，当温度低于21℃时就蛰伏不动，且以成虫过冬。因此，本研究采用5℃和10℃低温处理小胸鳖甲幼虫，这两个温度也是冷驯化经常设置的温度。另外，根据小胸鳖甲幼虫hsp70 基因表达的发育阶段性情况(图1)，分别选取1 龄(小龄)、4 龄(中龄)和7 龄(大龄)幼虫进行低温处理和hsp70 表达的检测，以便能够简洁地显示幼虫发育几个有代表性阶段的差异情况。结果显示经5℃和10℃处理后，1 龄幼虫hsp70 mRNA的相对水平与对照相比显著上升(图3A、3B)(P＜0.05)，在5 h 之内分别为对照的8.2 倍和14.1 倍;4 龄幼虫hsp70 基因的表达也受5℃和10℃低温诱导，但程度较弱，在3 h 仅为对照的2.0 倍和2.9倍;7 龄幼虫hsp70 基因的表达在长时间低温处理下甚至受到抑制(P＜0.05)，5℃处理3 h 和10℃处理5 h 之后仅为对照的17.7%和80.5%。但是7 龄幼虫在10℃1 h 时hsp70的表达受到诱导，为对照组的21.9 倍，之后迅速恢复原水平，甚至还有轻微抑制。总结5℃和10℃对小胸鳖甲幼虫hsp70 表达的影响，可以看出1 龄和4 龄幼虫hsp70的表达受低温诱导，并且10℃的诱导作用强于5℃，但1 龄幼虫的hsp70 对低温的响应远远高于4 龄，而7 龄幼虫hsp70 则在短时间内受10℃的强烈诱导。

2.6 小胸鳖甲幼虫的低温存活率

对小胸鳖甲1 龄、4 龄和7 龄幼虫分别进行低温处理，观察其在-10℃的存活率。结果表明，1 龄幼虫无论是否进行冷驯化，在-10℃的存活率都接近100%。4 龄和7 龄幼虫在-10℃的存活率分别为60%和41.7%。而5℃和10℃冷驯化可以使4 龄幼虫在-10℃的存活率从60%提高到85% (P＜0.05)(图4)。5℃冷处理对7 龄幼虫在-10℃的存活率无显著提高，10℃处理可增加其在-10℃的存活率，但与对照组无显著差异。

图4 小胸鳖甲1、4、7 龄幼虫低温处理后的存活率Fig.4 Survival of the 1st，4th，7th instar larvae of Microdera punctipennis under low temperature

3 结论与讨论

温度是影响荒漠地区生物生存的主要因素之一，由于昆虫是变温生物，温度对其生存有更直接的影响。HSP70 作为温度诱导表达型蛋白在生物对环境胁迫的响应中发挥作用。本研究对小胸鳖甲幼虫发育过程中hsp70 基因的表达及高低温对各龄幼虫hsp70 表达的影响进行了初步研究。由于幼虫在发育过程中发生了很大的生理生化改变，所以我们先对室温下幼虫发育过程中hsp 基因的内源表达进行了检测，结果表明小胸鳖甲大龄幼虫(6-7 龄)中hsp70的表达远远高于中小龄幼虫。幼虫不同龄期hsp70 差异表达的现象在其他昆虫中也有报道(Rybczynski and Gilbert，2000;Karouna-Renier et al.，2003;Mahroof et al.，2005;Xu et al.，2011)，表明HSP 参与昆虫的发育过程，帮助分化过程中大量新合成蛋白质的折叠。

目前研究的生物在高温胁迫时都可以合成热激蛋白，本研究表明小胸鳖甲幼虫hsp70 基因不仅响应高温胁迫，而且响应程度非常强烈，42℃处理1 h hsp70的表达量就达到对照的5.2-5290.7倍，其中2-5 龄可达一千至数千倍。荒漠昆虫hsp70 基因对高温如此强烈的响应程度在其他昆虫中未见报道。生活在同一地区的光滑鳖甲成虫在45℃处理5-15 min 就能显著诱导hsp70的表达(陈亮等，2007)。hsp 基因对高温胁迫的响应是在非正常生长温度下出现的，果蝇在37℃出现热激响应(Salvucci et al.，2000)，而荒漠昆虫是在37℃以上，表明适应沙漠环境的昆虫可以耐受更高的高温，并且响应非常迅速。值得注意的是，除1 龄幼虫外，小胸鳖甲各龄幼虫hsp70的表达对高温的响应程度与其本底水平呈显著的负相关，本底水平较低的2-5 龄幼虫hsp70的表达对高温的响应非常强烈，提示小胸鳖甲HSP70 在应对高温胁迫时发挥重要作用。对雌性B 型烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)和肩突硬蜱 Ixodes scapularis的hsp23/hsp20 和hsp70 基因进行RNA 干扰，影响了昆虫对高温胁迫的响应，降低了在高温下的存活率(Lü and Wan，2011;Busby et al.，2012)。抑制红尾肉蝇Sarcophaga crassipalpis hsp23或hsp70的表达会导致其非滞育蛹耐热性的降低(Rinehart et al.，2007)，表明hsp70 基因参与昆虫对高温的耐受，并发挥重要作用。

昆虫接受短时间温和低温胁迫后耐寒性增强的现象叫做冷驯化(cold acclimation) (Denlinger，1991)。冷驯化是昆虫对环境温度变化的一种生态适应机制，其中可能包含hsp 基因的表达 (Qin et al.，2005)。本研究中，小龄幼虫 (1 龄)hsp70 基因受5℃和10℃诱导而上调表达;中龄幼虫(4 龄)hsp70 基因对5℃和10℃低温的响应程度较弱;而大龄幼虫(7 龄)hsp70 基因除10℃胁迫1 h 上调表达外，在低温下受到抑制，表明不同龄期的幼虫对低温胁迫的程度和时间所做出的响应方式有较大不同。对黑腹果蝇的研究也发现其hsp70，hsp23 等基因的冷诱导表达和年龄显著相关(Colinet et al.，2013)。分析hsp70 表达与幼虫耐寒性的关系，发现两者之间没有直接对应关系。前期研究表明小胸鳖甲在1 龄幼虫期间不进食，依靠体内积累的大量营养物质生长，此时的过冷却点可达-21.8℃ (刘晓静等，2012)，因此1 龄幼虫无论是否冷驯化在-10℃的存活率都可接近100%，hsp70 基因表达对其耐寒性的影响可能在接近过冷却点的温度可以体现。4 龄幼虫存在显著的冷驯化现象，但是hsp70 在这两个温度下并没有表现出强烈的上调表达，所以冷驯化现象可能还与其他直接与耐寒性相关的物质合成有关，如抗冻蛋白或甘油等小分子渗透保护性物质(冯从经等，2007)。7 龄幼虫中冷驯化与hsp70 基因的表达之间也没有呈现出相关性。

通过本研究可得出如下结论:荒漠昆虫小胸鳖甲幼虫中hsp70 存在发育阶段性差异表达，中龄幼虫(3-5 龄)的表达最低，大龄幼虫(6-7龄)的表达最高;小胸鳖甲幼虫hsp70的表达受42℃高温的强烈诱导，其响应程度之高在其他昆虫中未见，表明HSP70 对荒漠昆虫小胸鳖甲应对高温胁迫发挥重要作用;冷驯化对小胸鳖甲幼虫hsp70的表达在不同龄期有不同的影响，与小胸鳖甲幼虫的耐寒性无直接相关性。本研究所得结果有助于全面认识HSP70 在荒漠昆虫环境适应性中的作用机制。

References)

Aruda AM，Baumgartner MF，Reitzel AM，et al.Heat shock protein expression during stress and diapause in the marine copepod Calanus finmarchicus［J］.Journal of Insect Physiology，2011，57(5):665-675.

Busby AT，Ayllón N，Kocan KM，et al.Expression of heat shock proteins and subolesin affects stress responses，Anaplasma phagocytophilum infection and questing behaviour in the tick，Ixodes scapularis［J］.Medical and Veterinary Entomology，2012，26 (1):92-102.

Colinet H，Lee SF，Hoffmann A.Temporal expression of heat shock genes during cold stress and recovery from chill coma in adult Drosophila melanogaster［J］.FEBS Journal，2010，277 (1):174-185.

Colinet H，Siaussat D，Bozzolan F，et al.Rapid decline of cold tolerance at young age is associated with expression of stress genes in Drosophila melanogaster ［J］.Journal of Experimental Biology，2013，216 (2):253-259.

Chen L，Zhang FC，Huang P，et al.Cloning and expression analysis of heat shock protein 70 gene from Anatolica polita borealis(Coleoptera:Tenebrionidae) ［J］.Acta Entomologica Sinica，2007，50 (9):883-888.［陈亮，张富春，黄萍，等.光滑鳖甲热休克蛋白70 基因的克隆及表达［J］.昆虫学报，2007，50 (9):883-888］

Denlinger DL.Relationship between cold hardiness and diapause.In:Lee RE，Denlinger DL，eds.Insects at Low Temperature ［M］.Chapman and Hall，New York and London，1991:174-198.

Feng CJ，Lu WJ，Dong QA，et al.Effect of lowtemperature treatment on larvae of the Asian corn borer，Ostrinia furnacalis (Guenee)(Lepidoptera:Pyralidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2007，50 (1):1-6.［冯从经，吕文静，董秋安，等.低温处理对亚洲玉米螟幼虫抗寒性的诱导效应［J］.昆虫学报，2007，50(1):1-6］

Feder ME，Hofmann GE.Heat-shock proteins，molecular chaperones，and the stress response:evolutionary and ecological physiology［J］.Annual Review of Physiology，1999，61 (1):243-282.

Gething MJ，Sambrook J.Protein folding in the cell ［J］.Nature，1992，355:33-45.

Guo R，Ebenezer V，Ki JS.Transcriptional responses of heat shock protein 70 (Hsp70)to thermal，bisphenol A，and copper stresses in the dinoflagellate Prorocentrum minimum ［J］.Chemosphere，2012，89 (5):512-520.

Gross TL，Myles KM，Adelman ZN.Identification and characterization of heat shock 70 genes in Aedes aegypti(Diptera:Culicidae)［J］.Journal of Medical Entomology，2009，46 (3):496-504.

Hou F，Ma J，Liu XN，et al.Seasonal changes in antifreeze protein gene transcription and water content of bettle Microdera punctipennis(Coleoptera:Tenebrionidae)from Gurbantonggut desert in central Asia ［J］.CryoLetters，2010，31 (5):359-370.

Huang LH，Chen B，Kang L.Impact of mild temperature hardening on thermotolerance，fecundity，and Hsp gene expression in Liriomyza huidobrensis［J］.Journal of Insect Physiology，2010，53 (12):1199-1205.

Huang LH，Kang L.Cloning and interspecific altered expression of heat shock protein genes in two leafminer species in response to thermal stress［J］.Insect Molecular Biology，2007，16 (4):491-500.

Huang LH，Wang CZ，Kang L.Cloning and expression of five heat shock protein genes in relation to cold hardening and development in the leafminer，Liriomyza sativa［J］.Journal of Insect Physiology，2009，55 (3):279-285.

Huang RX，Wu W，Mao XF，et al.The Fauna of the Drsert Insects of Xinjiang and Formation and Evolution ［M］.Urumqi:Xinjiang Science and Technology Press，2005，36-39.［黄人鑫，吴卫，毛新芳，等.新疆荒漠昆虫区系及其形成与演变［M］.乌鲁木齐:新疆科技出版社，2005，36-39］

Joanisse DR，Michaud S，Inaguma Y，et al.Small heat shock proteins of Drosophila:Developmental expression and functions ［J］.Journal of Biosciences，1998，23 (4):369-376.

Jiang XF，Zhai HF，Wang L，et al.Cloning of the heat shock protein 90 and 70 genes from the beet armyworm，Spodoptera exigua，and expression characteristics in relation to thermal stress and development［J］.Cell Stress and Chaperones，2012，17 (1):67-80.

Knorr E，Vilcinskas A.Post-embryonic functions of HSP90 in Tribolium castaneum include the regulation of compound eye development［J］.Development Genes and Evolution，2011，221(5-6):357-362.

Karl I，Sørensen JG，Loeschcke V，et al.HSP70 expression in the Copper butterfly Lycaena tityrus across altitudes and temperatures［J］.Journal of Evolutionary Biology，2009，22 (1):172-178.

Karouna-Renier NK，Yang WJ，Rao KR.Cloning and characterization of a 70 kDa heat shock cognate gene (HSC70)from two species of Chironomus［J］.Insect Molecular Biology，2003，12 (1):19-26.

Lindquist S.The heat-shock response ［J］.Annual Review of Biochemistry，1986，55 (1):1151-1191.

Liu XJ，Shi M，Ma J.Analysis and comparison of the supercooling point in larvae of Microdera punctipennis［J］.Xinjiang Agricultural Sciences，2012，49 (6):1080-1085.［刘晓静，石萌，马纪.小胸鳖甲各龄期幼虫过冷却点的测定［J］.新疆农业科学，2012，49 (6):1080-1085］

Lü ZC，Wan FH.Using double-stranded RNA to explore the role of heat shock protein genes in heat tolerance in Bemisia tabaci(Gennadius)［J］.Journal of Experimental Biology，2011，214(5):764-769.

Mahroof R，Zhu KY，Neven L，et al.Expression patterns of three heat shock protein 70 genes among developmental stages of the red flour beetle，Tribolium castaneum (Coleoptera:Tenebrionidae)［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular ＆Integrative Physiology，2005，141 (2):247-256.

Ma WJ，Ma J.Cloning and sequence analysis of a heat shock protein gene (Mphsp70)from Microdera punctipennis and its expression in relation to high temperatures ［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2012，49 (2):439-447.［马文静，马纪.小胸鳖甲热激蛋白基因(Mphsp70)的克隆、序列分析及温度对其表达的影响［J］.应用昆虫学报，2012，49 (2):439-447］

Qin W，Neal SJ，Robertson RM，et al.Cold hardening and transcriptional change in Drosophila melanogaster ［J］.Insect Molecular Biology，2005，14 (6):607-613.

Reuner A，Hengherr S，Mali B，et al.Stress response in tardigrades:differential gene expression of molecular chaperones［J］.Cell Stress and Chaperones，2010，15 (4):423-430.

Rinehart JP，Li AQ，Yocum GD，et al.Up-regulation of heat shock proteins is essential for cold survival during insect diapause［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104(27):11130-11137.

Rybczynski R，Gilbert LI.cDNA cloning and expression of a hormoneregulated heat shock protein (hsc 70)from the prothoracic gland of Manduca sexta ［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2000，30 (7):579-589.

Salvucci ME，Stecher DS，Henneberry TJ.Heat shock proteins in whiteflies，an insect that accumulates sorbitol in response to heat stress［J］.Journal of Thermal Biology，2000，25 (5):363-371.

Tang T，Liu FS，Ren GD.Cloning of HSP70 genes in a desert beetle Mantichorula semenowi Reitter (Coleoptera:Tenebrionidae)and their expression under heat shock ［J］.Acta Entomologica Sinica，2008，51 (4):365-371.［唐婷，柳峰松，任国栋.谢氏宽漠王HSP70 基因cDNA 片段的克隆及热激条件下的表达［J］.昆虫学报，2008，51 (4):365-371］

Udaka H，Ueda C，Goto SG.Survival rate and expression of Heat-shock protein 70 and Frost genes after temperature stress in Drosophila melanogaster lines that are selected for recovery time from temperature coma ［J］.Journal of Insect Physiology，2010，56(12):1889-1894.

Wang Y，Liu XN，Zhao J，et al.The rearing and biology of the desert beetle，Microdera punctipennis，under laboratory conditions［J］.Journal of Insect Science，2011，11 (38):1-12.

Xu Q，Zou Q，Zheng HZ，et al.Three heat shock proteins from Spodoptera exigua:Gene cloning，characterization and comparative stress response during heat and cold shocks ［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology，2011，159 (2):92-102.

Zhao L，Jones WA.Expression of heat shock protein genes in insect stress responses［J］.Invertebrate Survival Journal，2012，9:93-101.

Zhang QR，Denlinger DL.Molecular characterization of heat shock protein 90，70 and 70 cognate cDNAs and their expression patterns during thermal stress and pupal diapause in the corn earworm［J］.Journal of Insect Physiology，2010，56 (2):138-150.