长春新碱对人骨肉瘤细胞的效应及其作用机制研究

娄 楠，王 洋，刘国雄，黄岚峰

（1.深圳市龙华新区人民医院，广东 深圳518109；2.深圳市人民医院；3.吉林大学第二医院）

骨肉瘤的发病率近年来呈快速增长的趋势，并且日益年轻化，骨肉瘤的恶性程度高，进展快，化疗或放疗效果欠佳，数月内即可出现肺部转移预后较差[1]。寻找行而有效的骨肉瘤治疗方案仍是目前研究的焦点。建立骨肉瘤细胞系是对骨肉瘤生物学特性的深入研究的好办法。长春新碱（vincristine VCR）是一类二聚吲哚类生物碱，在治疗恶性肿瘤方面具有显著的疗效，迄今为止仍是主要的抗肿瘤药物之一[2－4]，但其对骨肉瘤的应用研究尚不明确。因此本文以原代培养建立的骨肉瘤细胞系HOS细胞作为体外实验的研究模型，分析VCR对细胞的增殖和凋亡的作用规律；检测VCR对细胞内JunB及c－Jun基因表达的影响，进而阐述药物作用的分子机理。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂RPMI－1640培养液 （Gibico USA），优等胎牛血清（Hyclone USA），CCK－8细胞活性检测试剂盒及Hoechest 33342细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），胰酶 （Promega USA），RNase free DNase I（Promega），Total RNA提取试剂盒（Invitr－ogen），实时荧光定量PCR试剂（ABI公司），RT－PCR试剂盒（TaKaRa），PCR引物由TaKaRa公司合成，长春新碱（哈尔滨医大药业有限公司）。

1.2 HOS的细胞培养及处理 标本离体后3h进行培养在无菌条件下将瘤组织置于培养皿中，先用Hanks液冲洗几次，然后去除结缔组织和坏死组织，将瘤组织剪成1－1.5mm3大小的组织块，再将剪碎的组织放在不锈钢网上（200目孔径），用Hanks液洗去红细胞及组织碎片，用贴壁方法将组织块接种于培养瓶内，瓶底朝上，同时加入含20%小牛血清及青、链霉素各100g／ml的RPMI－1640培养液4ml中，置37℃培养箱内，90min后待组织块粘贴瓶壁，再轻轻将培养瓶翻转，使组织块完全浸没于培养液中培养。将指数增长期的HOS细胞以106个的密度接种于6cm培养皿中，继续培养24 h，待细胞稳定生长后，分别加入0、5、10、20、50、100 μg.L－1不同浓度的VCR溶液，继续培养24h，进行下述检测。

1.3 细胞生长曲线的绘制 将指数生长期细胞接种于96孔培养板中，每孔接种1×103个细胞，分别标记不同的实验分组，每组设6个平行孔。于5%CO2、饱和湿度、37℃条件下在细胞孵育箱内进行培养24h，再向孔板中加入10μl的细胞活性检测试剂CCK－8溶液，孵育2h，然后测定490nm吸光度，进而绘制细胞的生长曲线。

1.4 凋亡的观察 将细胞置于1.5mL的EP管中，用缓冲溶液PBS清洗3次，以去除培养基残留，并加入相应浓度的凋亡检测试剂Hoechst33342，继续孵育30min后PS清洗3次，于荧光显微镜下观察。

1.5 相关mRNA表达水平的检测 按商品说明书进行总RNA的提取，对RNA进行RNase free DNase I处理，并将RNA逆转录为cDNA均。PCR引物序列：JunB上游引物，5’－CAG GCT ACC CCA ATG ATC C－3’；下 游 引 物，5’－CTT CCG CCT CTT TCT CCA GG－3’。GADD45上游引物，5’－GAG AGC AGA AGA CCG AAA GGA－3’；下游引物，5’－TGC TCC AGT AGT CTT TCA GGG AA－3’。内 参 RPL－13 上 游 引 物，5’－CGA GTT GGC TGG AAG TAC C－3’；下游引物，CTT CTG GCC TGT TTC CGT AG－3’。按照试剂盒说明书要求进行PCR反应。其相关程序为：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min；95℃、15s，60℃、30 s，95℃、15s，40个循环。经融解曲线证实PCR反应产物的特异性。将检测到的实验组的Ct值，与内参的Ct值进行比较，两者的差值即为该实验组的△Ct值，即实验组△Ct值＝实验组Ct值－内参组Ct值。同理可知对照组△Ct值＝实验对照组Ct值－内参对照组Ct值。通过实验组△Ct值与对照组△Ct值的比较，得出实验组各浓度的△△Ct值＝实验组△Ct值－对照组△Ct值。最后通过2（－△△Ct）来定量基因表达的改变。

1.6 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，结果以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 VCR改变HOS细胞增殖率 将浓度分别为1、2、5、10、20、50和100μg.L－1的 VCR 作用于HOS细胞24h后，我们可以发现，浓度为5μg.L－1时VCR可明确减低HOS细胞的增殖率（P＜0.05），且呈明确的剂量－效应关系，即随着浓度的增加抑制作用更显著（图1）。

2.2 VCR对HOS细胞凋亡的影响 将HOS细胞经凋亡检测试剂Hoechst33342染色，来直观反映VCR的效应。我们发现，活细胞胞核不染色或呈均匀淡染的蓝色，核形态良好，而凋亡细胞胞核固缩，浓染，呈现较明亮的着色区。对照组内细胞均为活细胞，罕有凋亡细胞；而VCR作用后出现较多典型的凋亡细胞。

图1 VCR可显著抑制HOS细胞增殖

2.3 VCR改变了HOS细胞相关基因的表达 VCR在5和20μg.L－1浓度，JunB的mRNA表达量显著减少（P＜0.05），分别为对照组的（47.42±9.12）%和（19.07±10.97）%，呈显著的剂量效应关系；而GADD45的mRNA表达量显著上调（P＜0.05），分别为对照组的0.95±0.07倍和2.45±0.09倍，呈明显的浓度依赖关系。结果表明VCR可以通过下调JunB基因的表达，及上调GADD45基因的表达来抑制HOS细胞增殖并促进其凋亡（图2）。

图2 VCR显著改变HOS细胞内JunB及GADD45的mRNA表达水平

3 讨论

VCR具有一定的神经系统毒性以及局部组织刺激作用，这也在某种程度上限制了其大剂量在肿瘤治疗方面的临床应用于[5]。本研究分析了VCR对骨肉瘤HOS细胞的抑制增殖和促进凋亡作用并深入探讨了其作用的分子机理。结果发现较低剂量（5μg.L－1）的VCR即可显著抑制细胞的增殖并促进其凋亡。且这一剂量远低于机体的中毒剂量（2 mg.kg－1），提示VCR在骨肉瘤化疗应用方面具有一定的应用前景，这也为本研究前期实验所证实[6]。

在细胞增殖的调控方面，JunB可以通过直接激活细胞周期蛋白cyclin A的转录来促进成骨细胞和成软骨细胞生长[7]。在肿瘤发生发展的过程中，JunB的高表达可能起到帮助肿瘤细胞免疫逃脱的作用[8]。本研究结果显示：VCR浓度为10μg.L－1时即可显著抑制HOS细胞的增殖（P＜0.05），且呈明确的剂量－效应关系；在5和20μg.L－1长春新碱作用下，MG63细胞内JunB的mRNA表达量均显著减少（P＜0.05），分别为对照组的47.42±9.12%和19.07±10.97%，呈明显的浓度依赖关系。表明：VCR可以有效下调HOS细胞内JunB的mRNA表达量，使细胞增殖率显著降低。这也提示JunB作为一种癌基因，在骨肉瘤的发生发展中起到促进作用，而VCR有效的抗骨肉瘤作用机制之一就是通过抑制细胞内JunB的表达来抑制增殖的。

细胞凋亡是化疗药物杀伤肿瘤细胞的重要机制。GADD45作为生长抑制及DNA损伤诱导基因家族的成员，对细胞凋亡、细胞周期阻滞及DNA修复都具有重要的作用[9，10]。本研究的结果显示：VCR作用后细胞内开始出现一些散在分布的胞核固缩，浓染，呈现较明亮的着色区的凋亡细胞；GADD45的mRNA表达量显著上调（P＜0.05），分别为对照组的0.95±0.07倍和2.45±0.09倍，呈明显的浓度依赖关系。因此我们认为，VCR可以显著上调HOS细胞内GADD45的mRNA表达量，促进细胞发生凋亡。这也揭示出另一条VCR有效抗骨肉瘤的作用途径。

综上所述，VCR在较低浓度即可抑制骨肉瘤HOS细胞的增殖，且远低于中毒剂量，这就表明其可能应用为骨肉瘤的一线化疗药物；而VCR有效的抗骨肉瘤作用机制之一就是通过抑制细胞内JunB的表达来抑制增殖的；同时VCR又可以显著上调细胞内抑癌基因GADD45的表达，促进细胞发生凋亡，这也揭示出另一条有效的对抗骨肉瘤的作用途径。

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