中药复方对热应激肉兔肠道组织结构及肝脏抗氧化机能的影响

王自力，张 翥，唐 琪，涂君平，王明周，王陈超，贺庭祯

（西南大学动物科技学院，重庆 北碚 400715）

热应激是指在高热环境下机体对热环境对机体提出的任何要求所作出的非特异性的生理反应的总和。重庆地区夏季气温常在30℃以上，甚至可达45℃，而肉兔生长最适温度为15℃～25℃，当环境温度超过30℃时，可引起应激反应，导致机体免疫力下降，甚则发生疾病死亡。本文通过研究高温应激对肉兔的肠道组织结构及肝脏抗氧化机能的影响，并对中药复方的调控作用进行研究，为研制肉兔抗热应激中药提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 选择35日龄，体重在650～750 g之间的健康新西兰肉兔24只（购自重庆市合川区涞滩镇邓银养兔场）。随机分为对照组、热应激、中药组，每组8只，雌雄各半。预饲期为7 d，试验期为21 d。

1.2 药品与仪器

1.2.1 中药复方制备藿香、苍术、石膏、黄柏、连翘、黄连、栀子等药物按一定比例混合，中药均购自重庆市北碚区桐君阁大药房。将各中药置于35℃烘箱内干燥4 h，粉碎后经100目钢筛过筛后，按5%比例加入肉兔配合饲料（成都市新津金阳饲料有限公司，批号：20100802）中，于西南大学饲料与营养实验室重制粒。

1.2.2 试剂及药品 谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（批号：20100720）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（批号：20100720）、总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（批号：20100720）、超氧化物歧化酶（SOD）（批号：20100720）检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；乙醇、苏木精、二甲苯等。

1.2.3 仪器设备 UV 570型紫外分光光度计，Sigma低温高速离心机，LEICA RM-2016型切片机、中药粉碎机，KYW32型饲料制粒机、WD-02A型干燥箱等。

1.3 动物处理方法 在重庆高温8月时，将对照组肉兔饲喂于25℃～28℃，65%湿度环境中，热应激组及中药组肉兔饲喂于高温环境中（30℃～37℃，65%湿度）。对照组和热应激组给予常规饲料，中药组给予含5%中药复方的饲料，采用分栏饲喂，自由采食和饮水，试验期为21 d。

1.4 样品采集与指标测定 于第22天处死各组肉兔，分别采集十二指肠、空肠、回肠于4%中性甲醛中固定，同时采集肝脏于冻存管中，-80℃保存备用。制作肉兔十二指肠、空肠、回肠的组织切片，H.E.染色，观察肠道组织结构变化；按照试剂盒说明书，制作肝脏组织匀浆，3 000 r/min离心10 min后取上清测定总蛋白含量后，分别测定总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力。

1.5 数据统计与分析 采用SPSS 11统计软件进行单因素方差（one-way ANOVA）分析，结果以-X±SD表示。

2 结果

2.1 环境温度变化 由图1可知，环境热应激温度均高于30℃，对照组环境温度均未高于28℃，肉兔在环境温度高于30℃时，均发生热应激。

2.2 肉兔肠道组织结构变化 对照组：十二指肠、空肠和回肠黏膜结构完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，染色鲜明，排列规则，肠道各层组织均完整（图2-A、图3-A、图4-A）。

热应激组：十二指肠、空肠黏膜上皮脱落固有层裸露，黏膜下水肿，肠腺萎缩，顶端绒毛脱落，肠道微血管内充血肿胀（图2-B、图3-B）；回肠各组织结构基本完整（图4-B）。

中药组：十二指肠、空肠和回肠黏膜结构基本完整，层次分明，肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰，排列较整齐，肠绒毛结构完整（图2-C、图3-C、图4-C）。

2.3 肉兔肝脏组织抗氧化指标含量变化 由图5可知，热应激组肉兔肝脏组织T-AOC显著低于对照组和中药组（P＜0.05），而对照组和中药组无显著差异（P＞0.05）；由图6可知，热应激组肉兔肝脏总SOD活性显著低于对照组和中药组（P＜0.05），而中药组和对照组无显著差异（P＞0.05）。

由图7可知，热应激组肉兔肝脏MDA含量显著高于对照组和中药组（P＜0.05），而中药组与对照组无显著差异（P＞0.05）；由图8可知，热应激组肉兔肝脏GSH-PX活性高于对照组和中药组，但各组肉兔肝脏GSH-PX活性无显著差异（P＞0.05）。

3 分析与讨论

肉兔是恒温动物，最适生长温度为15℃～25℃，最适湿度为60%～65%。当肉兔处于高温高湿环境中时可发生应激反应，引起代谢率降低[1-2]，出现增重速度下降，生长缓慢，肉质变差，种兔配种受胎率下降等；刺激促肾上腺素的合成与分泌，使糖皮质激素增加而降低体液免疫和细胞免疫功能，导致免疫器官萎缩和抗体合成减少等，从而诱发多种疾病给肉兔养殖造成巨大经济损失[3]。

3.1 肠道组织结构变化 小肠的绒毛完整性及结构的完整性是衡量小肠消化吸收功能的重要指标，与动物生长速度呈正相关关系[4]。本研究表明，肉兔在高温热应激后，肠黏膜结构损伤严重，尤其是十二指肠和空肠受损最为严重（图2-B和图3-B），导致肉兔肠道吸收能力减弱。现有研究表明，热应激后肉兔肠黏膜结构严重损伤，各肠段的绒毛长度、宽度、隐窝深度，绒毛长度/隐窝深度均出现不同程度的降低[4]，进一步印证了肉兔的热应激反应可导致肠道组织结构受损。同时，在高温环境中给予中药后，肉兔肠绒毛、肠腺结构基本保持完整，肠黏膜损伤程度较低（图2-C、图3-C、图4-C），说明中药复方可明显减轻高温应激对肉兔肠道组织的损伤。

由于重庆地区夏季常为高温高湿天气，为湿热之邪，易郁阻中焦脾胃，引起脾胃运化功能受阻，治宜清热祛湿。本试验中药复方由藿香、黄柏、苍术、石膏、连翘、黄连、栀子等七味药组成，具有清热解暑、利湿健脾功效。研究表明，以藿香、黄柏、苍术、石膏为组成的中药复方可有效减轻热应激对猪肠道结构和黏膜免疫机能的损害[5-6]。因此，本中药复方具有维护热应激肉兔肠道组织结构的完整性的功效，可有效清解肉兔在高温高热环境下感受的湿热之邪，维护中焦脾胃功能正常，有利于肉兔的正常生长。

3.2 肝脏抗氧化指标变化 在动物有机体处在正常的生理状态下，自由基的产生与清除处于动态平衡状态。当发生衰老和应激时，机体代谢发生紊乱，产生大量的自由基，机体若不能及时清除多余自由基，可造成自由基大量蓄积，可导致组织细胞膜完整性受到损害，引起机体免疫力和抵抗力下降。

3.2.1 总抗氧化能力（T-AOC）的变化 T-AOC代表机体防御体系的抗氧化能力，是衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标[7]。本研究表明，在高温条件下，热应激组肉兔肝脏组织总抗氧化能力出现了显著下降，说明肉兔的抗氧化酶系统和非酶系统对外来刺激的代偿能力出现显著下降，且机体自由基代谢加快，体内自由基增多，导致肝脏组织总抗氧化能力下降；中药复方可有效维护肉兔机体的代偿能力和抗氧化能力于正常水平，即中药复方具有增强肉兔肝脏组织抗氧化能力的功效。研究表明，黄连、连翘、栀子、藿香、黄柏均具有抗氧化功效，可有效清除自由基对机体组织细胞的损害作用，维持机体组织抗氧化能力[6，8-11]。

3.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）变化SOD是机体中的一种重金属酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，可清除超氧阴离子自由基，发挥抗炎作用，反映机体清除氧自由基能力；MDA是脂质过氧化中产生的脂质过氧化产物，可引起黏膜损伤和激活补体系统，使巨噬细胞释放大量炎症介质[12]，反映细胞脂质过氧化程度。本研究表明，热应激组肉兔肝脏组织中SOD活性显著下降，MDA含量则显著上升，说明热应激加速了肉兔机体组织的脂质过氧化作用，并导致其抗氧化能力下降，可引起机体自由基增多，破坏体内的抗氧化酶系统，导致组织损伤和疾病的发生。中药复方可有效降低热应激肉兔的脂质过氧化作用，增强机体抗氧化能力，即中药复方可保持肉兔机体内氧自由基的产生和清除处于平衡状态，作为机体“正气”之一的SOD水平仍然保持在正常水平。研究表明，连翘具有恢复小鼠血清SOD、乳酸脱氢酶（LDH）和MDA含量正常的功效[13]。

3.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的变化GSH-PX是机体内重要的过氧化物酶，具有清除体内H2O2和脂类氢过氧化物，阻断脂质过氧化连锁反应，具有保护细胞结构和功能完整的作用。研究表明，热应激可引起活性氧的释放、氧自由基的堆积，过氧化物产生越多，GSH-PX活性下降越明显[7]。在本研究中，热应激组肉兔肝脏GSH-PX活性虽高于对照组和中药组，但无显著差异（P＞0.05），说明夏季高温应激中，肉兔可能通过其他途径如增强SOD活性来清除自由基等因素有关，其具体原因需进一步研究。

综上所述，热应激可引起肉兔肠道组织结构损伤，尤以十二指肠和空肠最为明显，肝脏组织中T-AOC、SOD含量下降，MDA含量上升，导致肉兔肝脏组织抗氧化能力下降；中药复方可有效减轻热应激对肉兔肠道组织结构的损伤，并可维持热应激肉兔肝脏组织抗氧化能力于正常水平，其作用机制需进一步研究。

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