山东省部分地区禽源致病性大肠杆菌的血清流行病学调查与耐药性检测

刁有江，范学政

（1.山东农业工程学院，济南250100；2.中国兽医药品监察所，北京100081）

禽大肠杆菌病是由某些致病性大肠杆菌引起的家禽多种传染性疾病的总称［1-3］。该病是山东省规模化养禽场的常见病，发病率高，死亡率高，常与慢性呼吸道病、H9亚型禽流感等呼吸道疾病混合感染，给养禽业造成极大损失。为了有效开展禽大肠杆菌病的预防和治疗工作，本研究对采自山东潍坊、烟台、临沂等8地市的家禽病料进行了禽源致病性大肠杆菌的分离、血清型流行病学调查，并对分离到的大肠杆菌进行了耐药性检测和分析，以期为疫苗的研制和临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料 在2012年1～12月间，从山东省潍坊、临沂、青岛、烟台、德州、滨州、聊城、济宁8个地区的45家养禽场收集到128只初诊为大肠杆菌病的病死鸡。无菌采集病死鸡的肝脏、脾脏、心血等病料，用于病原菌的分离。

1.2 大肠杆菌标准抗O血清 20种大肠杆菌单因子抗O血清由中国兽医药品监察所提供。

1.3 试验动物 10日龄健康海兰白雏公鸡购自济南百事得牧业有限公司养鸡场。

1.4 质控菌株 大肠杆菌 ATCC25922、ATCC35218由吉林大学畜牧兽医学院兽医药理实验室惠赠。

1.5 培养基和试剂 麦康凯培养基为北京奥博星生物技术责任有限公司产品；MH肉汤、LB肉汤为杭州天和微生物试剂有限公司产品；普通营养琼脂及葡萄糖、甘露醇、麦芽糖等10种生化培养基等为上海市医学化验所试剂厂产品。磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠等试剂为天津金汇太亚化学试剂有限公司产品。

1.6 抗菌药物 氟苯尼考、硫酸粘菌素、痢菌净、土霉素、磺胺甲基异噁唑、甲氧苄啶为济南美事达兽药有限公司惠赠，其他药品均购自中国食品药品检定研究院。

1.7 病原菌的分离培养 无菌采集病死鸡的肝脏、脾脏、心血等病料，划线于麦康凯斜面，37℃培养18 h，挑取典型菌落在麦康凯平板上分区划线，37℃培养18 h，选取单个典型菌落纯培养后4℃冰箱暂存备用。取培养物，按常规方法进行涂片、革兰氏染色，对菌体形态、染色特性及荚膜进行镜检。

1.8 生化特性 按常规方法［4］，对分离到的大肠杆菌进行三糖铁试验、吲哚试验等生化测定。

1.9 血清型鉴定 取被检细菌纯培养物用生理盐水离心、洗涤2次，稀释成100×108／mL的菌悬液，用水煮沸2.5 h，破坏其荚膜抗原。应用微量凝集试验，用大肠杆菌标准抗“O”血清，对所分离的菌株进行血清型的鉴定［5］。定型标准为血清的试管凝集价不小于 1 ∶640［3］。

1.10 致病性试验 挑取普通琼脂斜面上纯培养的菌落，接种于LB肉汤培养基中，静置培养24 h作为接种液。每株大肠杆菌培养物各随机腹腔注射5只10日龄健康雏公鸡0.2 mL（每mL含约108CFU），作为一个试验组。另取5只雏公鸡腹腔注射0.2 mL肉汤作为对照。在96 h内观察其发病与死亡情况，并进行细菌的分离。根据鸡的死亡数确定分离株的致病性［1］：接种鸡死亡率超过50%，定为高致病株；接种鸡有死亡，但死亡率低于50%，定为中等致病株；接种鸡96 h内无死亡，定为低致病性分离株。

1.11 耐药性检测 参考美国临床和实验室标准化研究所（CLSI）出版的抗菌药物敏感试验执行标准中的药敏试验方法［6］，采用微量肉汤稀释法对大肠杆菌分离株进行耐药性检测，并以大肠杆菌ATCC25922和ATCC35218为质控菌株。本研究中所用抗菌药物的种类、相应的测定浓度及药敏试验结果判定标准见表1。中介菌株计入耐药株范围内。

表1 抗菌药物的种类、测定浓度及判定标准

2 结果

2.1 细菌分离 从128份病死鸡中，共分离到细菌103株。

2.2 生化反应 经生化鉴定，有96个分离株的生化反应符合大肠杆菌的特征。

2.3 血清型鉴定 对分离鉴定的96株致病性大肠杆菌进行血清型鉴定，共鉴定出75株大肠杆菌的血清型，占分离菌株的78.13%。此外，有15个分离株未能定型，占分离菌株的15.62%；有6个分离株发生自凝，占分离菌株的6.25%。

75株定型的菌株分属18种血清型（表2），优势血清型为 O78、O2、O18、O15、O88、O143，这 6 种血清型的菌株占定型菌株的64%。

表2 已定型的75个分离株的血清型

2.4 致病性试验 雏鸡接种大肠杆菌后96 h内，有94个试验组死亡率超过50%，另外2个试验组的接种鸡有死亡但死亡率低于50%，从接种后死亡鸡体内均能分离到接种菌。健康对照鸡均健活。说明本次分离到的大肠杆菌有94株为高致病性大肠杆菌，其他2株为中等致病性大肠杆菌。高致病株引起接种鸡高死亡率，致死比例多为4／5～5／5；中度致病株引起接种鸡较低死亡率，致死比例为1／5～2／5。接种后 24 h以内死亡的试验鸡眼观病变主要表现为心包积液、气囊混浊以及肝脏肿大、淤血；接种48 h以后死亡的试验鸡，可以见到纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等典型病变。高致病性分离株引起试验鸡在接种后24 h内出现死亡高峰。已定型的75个分离株的致病性试验结果详见表3。

表3 75株已定型大肠杆菌的致病性试验结果

2.5 耐药性检测 96株大肠杆菌对20种药物的敏感性检测结果如表4。质控菌株大肠杆菌ATCC25922、ATCC35218的测定结果均在质控范围内，说明药物敏感性检测结果可靠。

在被测药物中，75%以上的菌株对氨苄青霉素、阿莫西林、土霉素、痢菌净、恩诺沙星等5种抗菌药耐受，所有大肠杆菌分离株对土霉素均表现为耐药；除此之外，还有50%以上的菌株对卡那霉素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、磺胺甲基异噁唑／甲氧苄啶以及粘菌素等7种抗菌药表现为耐药。除土霉素外，经χ2检验，针对某种抗菌药的敏感菌株在各地区的分布情况，存在一定差异，但总体差异不显著（P＞0.05）。

表4 抗菌药物敏感性试验结果

2.6 大肠杆菌的多重耐药性 96株大肠杆菌对被测的20种药物存在不同程度的多重耐药现象（图1），受检菌至少对4种药物耐受；75%的受检菌对9种及9种以上的被测药物耐受，耐药类型为10～14重耐药的大肠杆菌所占比例最大，占受检菌的58.33%。对被测药物耐受种类最多的大肠杆菌有2株，耐药类型为17重耐药，占受检菌的2.08%。96株大肠杆菌共有57种耐药谱。

图1 96株大肠杆菌多重耐药类型图

3 结果

3.1 一般认为，禽源致病性大肠杆菌血清型最常见的为 O1、O2、O35和 O78［2］，本研究鉴定山东部分地区的优势血清型为 O78、O2、O15、O18、O88、O143，与国内资料报道的山东地区的优势血清型有相吻合的部分，也有差异存在［7-10］。通过对省内一些养禽场的跟踪调查发现，同一禽场同批发病禽群中存在多种血清型，且同一禽场在不同时期流行株的血清型也有所差异，不同禽场之间差异更大。因此，在大肠杆菌的免疫预防中，应充分考虑其血清型的多样性、易变性。本次试验中血清型的鉴定为山东省禽大肠杆菌病的防制提供了理论依据。

3.2 据报道，某种抗菌药物耐药率的多少与区域内该药物的使用频度成正比［11］。细菌长期接触某种抗菌药物所产生的选择性压力导致了耐药性的产生［12］。本次试验中受检菌株对用药历史较久、应用广泛的常规抗菌药物如土霉素、氨苄青霉素、恩诺沙星、痢菌净、阿莫西林等耐药严重。法定兽用抗菌药中仅有使用频率较低的阿莫西林／棒酸敏感率高。曾对大肠杆菌比较敏感的氟苯尼考、庆大霉素、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星等在广泛使用的过程中均产生了不同程度的耐药性。除阿莫西林／棒酸以外，细菌对尚未批准为兽用药、使用频率相对较低的头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、阿米卡星、加替沙星敏感率较高。

本研究的多重耐药情况与刘远飞等的报道相近［13］，说明禽源致病性大肠杆菌的多重耐药性在山东地区普遍存在。禽源致病性大肠杆菌多药耐药性产生的原因，与长期以来我国养禽业从业者对抗菌药物的滥用有关［14］。通过对省内一些规模化养禽场的跟踪调查发现，无指征投用抗菌药物的现象普遍存在。抗菌药物的不规范使用导致了多药耐药性致病性大肠杆菌的散播［15］。

因此，规模化养禽场在加强饲养管理的同时，应定期进行大肠杆菌的分离鉴定和抗菌药物敏感性的检测。选用有针对性的菌株作为菌苗；根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意规范用药，必要时可以进行联合用药，以有效控制大肠杆菌病的流行。

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