QuEChERS样品前处理-高效液相色谱法测定动物组织中那西肽残留量

陈慧华，应永飞，杜旭奕，罗成江，周芷锦

（浙江省兽药饲料监察所，杭州310020）

那西肽（Nosiheptide）是一种含硫多肽类抗生素，其结构式见图1。那西肽对畜禽有明显的促生长作用，对环境影响小、对人畜安全，且不易产生耐药性等优点，目前欧美和日本均已批准其在畜禽养殖中使用［1-2］。1998年我国将其批准为国家三类新兽药［3］，被农业部168号公告列为可在饲料中长期添加使用的药物添加剂［4］，已广泛应用于畜禽养殖业。为保障动物源性食品的安全性，国际上纷纷制定了那西肽的残留限量和检测方法，如日本肯定列表制定规定了鸡和猪肌肉、肝脏等组织中那西肽的最高残留限量均为 30 μg／kg［5］，美国 AOAC 已制定了动物组织中那西肽的检测方法［6］。由于我国还未制定动物组织中那西肽残留限量和检测方法标准，为完善那西肽安全用药体系，迫切需要建立动物组织中那西肽残留的检测方法。

图1 那西肽的分子结构式

目前，针对动物组织中那西肽残留检测的研究很少，主要以饲料和兽药检测为主，包括微生物检定法［3］、气质联用法［7］和液相色谱法［3，6，8-9］，其中气质联用法需要进行衍生化等复杂前处理；液相色谱法不需要进行衍生化处理，操作更为简便。近年来，QuEChERS检测技术以其快速、简易、廉价、有效、稳定、安全等特点在农、兽药残留和霉菌毒素检测领域得到了广泛应用［10-11］，本文研究采用QuEChERS前处理方法，结合高效液相色谱荧光检测法，建立了动物组织中那西肽残留量检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪-2475荧光检测器，配 Empower 2软件，美国 Waters公司；METTLER TOLEDOXS-205电子天平（感量0.01 mg）；SL502 N电子天平（感量0.01 g）；KQ-500E型超声波清洗器；Sigma 3k30型冷冻离心机；BüCHI B-490旋转蒸发仪；AM-6匀浆机；IKA MS2 minishaker涡旋混匀器。

1.2 试剂 那西肽标准品，由浙江汇能动物药品有限公司提供，纯度大于95.0%；无水硫酸镁、C18、PSA、GCB均为QuEChERS专用材料，美国Agilent公司；乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺为色谱纯，Merck公司；实验用水为milli-Q超纯水；磷酸、正丙醇、无水硫酸钠等为分析纯。

1.3 标准品溶液 准确称取那西肽标准品25 mg于25 mL容量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺溶解后稀释至刻度，配制成浓度为1.0 mg／mL的标准储备液；吸取标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0 μg／mL的标准工作液；吸取适量体积的标准工作液，用流动相稀释成含那西肽为 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 和2.0 μg／mL 的标准系列工作液。

1.4 试验方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；荧光检测条件：激发波长327 nm，发射波长521 nm；流动相：0.025%磷酸溶液／乙腈（52：48，V／V）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL／min； 进样量：20 μL。

1.4.2 样品前处理 称取（5±0.05）g试样于50 mL离心管中，加入25 mL乙腈，高速匀浆1 min，加入无水硫酸钠3 g，中速振荡提取10 min；于8000 r／min离心5 min，倾出上清液至另一50 mL离心管中，剩余残渣用20 mL乙腈重复提取一次，合并两次提取上清液；提取液中加入150 mg C18和100 mg无水硫酸镁，中速振荡5 min，于8000 r／min离心5 min，倾出上清液至鸡心瓶中，加入5 mL正丙醇，40℃下旋转蒸发至干；准确加入2.0 mL流动相至鸡心瓶中，涡旋混匀1 min溶解残余物，过膜后上机测定。

2 结果

2.1 标准曲线及回收率 取1.3项标准系列工作液，按浓度从低到高依次进行高效液相色谱分析，每个浓度重复进样3次。以峰面积y对浓度x（μg／mL）作标准曲线，得回归方程为y＝1691662x－18247，线性相关系数r2＝0.9998。结果表明，那西肽在0.01～2.0 μg／mL的浓度范围内，呈现良好的线性关系。

2.2 检测限和定量限 以猪、鸡肌肉和肝脏等典型畜禽产品为样品基质，添加适量那西肽标准工作液进行试验，考察方法的检测限和定量限。经回收率试验，当动物组织中添加那西肽为5 μg／kg时，信噪比（S／N）均大于3；当动物组织中添加那西肽为 10 μg／kg 时，信噪比（S／N）均大于 10，所以本方法的检测限为 5 μg／kg，定量限为 10 μg／kg。 由于那西肽是允许使用的药物饲料添加剂［4］，且检测浓度大大低于日本肯定列表规定的30 μg／kg的要求［5］，完全能满足实际样品检测的需要。

2.3 准确度和精密度 取猪、鸡肌肉和肝脏样品进行加标回收率试验，系统考察方法的准确度和精密度。 分别进行 10、20、100 μg／kg 添加浓度的回收率实验，每批次同一浓度做5个平行，每个浓度重复3次，分别计算批内、批间相对标准偏差，回收率试验结果见表1。

表1 不同动物组织中那西肽回收率试验结果（n＝5）

从回收率结果看出，猪、鸡肌肉和肝脏在10～100 μg／kg添加浓度范围内，平均回收率为73.8%～93.0%，批内相对标准偏差（RSD）在1.3%～11.1%之间，批间相对标准偏差（RSD）在2.9%～10.9%之间，可见本方法能满足动物组织中那西肽测定的需要。图2是添加浓度为20 μg／kg时，那西肽标准溶液、猪肝空白样品溶液和猪肝添加样品溶液高效液相色谱图，箭头所示为那西肽峰。

2.4 实际样品检测 采用建立的检测方法对市场随机抽检的109份猪肝、猪肉、鸡肉样品进行了检测，结果未发现那西肽阳性样品。

3 讨论

3.1 荧光检测条件的确定 目前，国内外文献报道液相色谱法测定那西肽的方法中，检测器包括紫外检测器和荧光检测器两种。紫外检测器主要用于兽药和饲料样品含量测定，波长包括330 nm［3］和241 nm［9］，实验中发现检测灵敏度很低，杂质干扰严重，无法满足药物残留检测要求。本文参考文献［6，8］的方法，采用荧光检测器进行检测，比较了激发波长357 nm、发射波长500 nm和激发波长327 nm、发射波长521 nm两种检测条件，发现采用后者条件的灵敏度更高，杂质干扰更少，因此确定荧光检测条件为激发波长327 nm、发射波长521 nm。

图2 标准溶液（A）、猪肝空白样品溶液（B）和猪肝添加样品溶液（C）高效液相色谱图

3.2 液相色谱分离条件的确定 由于那西肽属于含硫多肽类抗生素，极性较弱，可采用C18柱作为分析柱进行分离。本研究对Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、Waters Atlantis C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、 Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱等三种规格的色谱柱进行了比较，结果表明分离结果均较为满意。在流动相选择上，比较了磷酸盐缓冲液／乙腈、磷酸溶液／乙腈和水／乙腈体系的色谱保留性能和灵敏度，结果发现，磷酸溶液／乙腈流动相体系那西肽峰型最好、灵敏度最高。进一步优化磷酸溶液浓度和流动相配比，使那西肽获得最佳峰型和保留时间，最终确定流动相为0.025%磷酸溶液／乙腈为52／48（V／V），流速为 1.0 mL／min。

3.3 样品前处理方法的优化 那西肽分子量较大，在水、乙醇、丙酮和三氯甲烷中不溶或微溶，同时考虑到动物组织中蛋白质、脂肪含量高等特点，本研究采用乙腈作为提取剂，蛋白沉淀效果较为理想，结合QuEChERS方法对提取液进行了净化。通过加标回收试验发现，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和石墨化炭黑（GCB）对那西肽吸附能力很强，净化后回收率都很低，而C18和MgSO4不仅对杂质有一定的吸附能力，且对那西肽的回收率影响小，优化使用量后达到了较好的效果。

3.4 干扰试验 考察在本文色谱条件下，其他类似药物对那西肽分析方法的干扰。以目前养殖环节常用多肽类抗生素硫酸粘菌素、恩拉霉素、杆菌肽锌为代表进行干扰试验，采用那西肽色谱条件进行检测，结果显示在该色谱条件下以上化合物均未出现色谱峰。

4 结论

本文采用QuEChERS样品前处理-高效液相色谱法建立了动物组织中那西肽残留量的分析方法。该方法采用QuEChERS技术对样品前处理条件进行系统优化，建立了快速、简易、廉价、有效、稳定、安全的前处理技术，并系统考察了液相色谱检测条件，提升了检测灵敏度。在本实验的色谱条件下，被测药物与杂质得到了较好的分离，出峰时间合适。实验结果表明，该方法条件易于控制，灵敏度高、结果准确、加标回收率稳定、重现性好，能够满足日常检测的要求，适用于动物组织中那西肽残留量的测定。

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［4］农业部.农业部168号公告饲料药物添加剂使用规范［S］.

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