重组人粒细胞集落刺激因子对大鼠脑缺血再灌注损伤后p－JAK2及p－STAT3信号通路的影响

徐海发 蒋晶晶 马静萍

重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony－stimulating factor，rhG－CSF）已被广泛的用于治疗各种原因引起的粒细胞减少症，近年研究发现，rhG－CSF具有抗细胞凋亡、抑制炎性反应、促进神经分化、免疫调节等作用，对神经系统具有明显保护作用，当脑组织发生缺血再灌注损伤时其不仅释放大量炎性细胞因子〔如肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、白细胞介素－1（IL－1）、白细胞介素－6（IL－6）等［1］〕和氧自由基，同时还可以激活酪氨酸激酶－信号转导子和转录因子（JAK－STAT）信号转导通路［2］，介导细胞凋亡途径。本实验通过线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，观察rhG－CSF对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经功能评分、脑梗死体积、磷酸化酪氨酸激酶－2（p－JAK2）、磷酸化信号转导子和转录活化子－3（p－STAT3）表达及神经细胞凋亡的影响，旨在探讨rhG－CSF神经保护作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:SD健康雄性大鼠60只，体质量250～300g，由山西医科大学动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂:rhG－CSF购自山东齐鲁制药有限公 司，TTC、p－JAK2（Y221）PAb、p－STAT3（S727）pAb、TUNEL试剂盒、二步法免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺血再灌注模型的制作及神经功能评分:采用随机数字表法随机选取36只大鼠，分为假手术组、脑缺血再灌注组和rhG－CSF治疗组（治疗组）3组，每组12只。采用Longa等［4］的线栓法建立大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO／R）模型，于缺血2h后实施再灌注。假手术组仅分离颈部动脉而不插入鱼线，余相同。MCAO／R模型完成后，治疗组于再灌注的同时及24h后按体质量50μg／kg分别给予腹部皮下注射rhG－CSF，假手术组和脑缺血再灌注组分别予等量生理盐水。

以Longa 5分制法［4］为评分标准进行神经功能缺损评分，假手术组大鼠于术后清醒时进行评分，治疗组和脑缺血再灌注组大鼠于缺血再灌注后清醒时进行评分。0分:无神经损伤症状；1分:不能伸展左前肢；2分:行走时往左侧转圈；3分:行走时向左倾倒；4分:不能自行行走，意识丧失。0分与4分的大鼠被剔除，按照相同的随机原则补足每组相应的只数，确保每组有12只大鼠进入实验。24h、48h后参照Longa 5分制评分法每组中随机选6只行神经功能评分及TTC染色测定脑梗死体积［3］，另外的6只用于免疫组化法和TUNEL技术分别检测p－JAK2和p－STAT3蛋白表达及细胞凋亡情况。

1.2.2 脑梗死体积测定（TTC染色法）:每组取6只大鼠，于缺血再灌注48h后迅速断头取脑后置入－20℃冰箱内，30min后取出并自视交叉水平行5个脑冠状切片，片厚约2mm，将其置于2%（质量浓度）TTC氯化钠溶液中，37℃避光孵育40 min，染色后置10%（质量浓度）甲醛溶液中在4℃条件下避光固定24h，肉眼观察后用数码相机（型号DSC－W730）拍照，利用计算机病理图像分析仪（型号N200683003115）计算脑梗死体积。

1.2.3 p－JAK2和p－STAT3蛋白表达:每组取6只大鼠，于脑缺血再灌注48h后用10%（质量浓度）水合氯醛按体质量0.3mL／100g腹腔注射麻醉，经心脏用生理盐水灌注至流出清亮液体后再用4%（质量浓度）多聚甲醛行内固定，然后断头取脑，将其浸入10%（体积分数）甲醛中行外固定24h，取视交叉前后2mm的脑组织行冠状切片，片厚约2um。采用免疫组化法（SV002兔－IgG－两步法）检测p－JAK2和p－STAT3蛋白表达，具体步骤按照试剂盒说明书进行。切片置250倍显微镜下观察，细胞胞浆、胞核染为棕褐色或有棕褐色颗粒沉积者为p－JAK2蛋白阳性细胞，以细胞核染为棕褐色或有棕褐色颗粒沉积者为p－STAT3蛋白阳性细胞。用BI－2000医学图像分析系统测量阳性细胞的灰度值，其灰度值与p－JAK2和p－STAT3阳性细胞数量成反比。

1.2.4 细胞凋亡检测:各组“1.2.3”中的每张切片均采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，其具体操作按说明书进行。将切片置显微镜下250倍视野观察，胞核中出现棕黄色颗粒者为凋亡细胞。于每张切片中选择5个不重复的250倍视野，计算出各个视野内凋亡细胞总数占总细胞数的百分比，并计算其平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行分析。数据用均数±标准差表示。用Levene Statistic法进行方差齐性检验，Shapiro－Wilk法进行正态性分析，大鼠脑组织中p－JAK2、p－STAT3蛋白表达灰度值、凋亡细胞数、脑梗死体积符合正态性分布及方差齐性检验，神经功能缺损评分不符合正态性分布及方差齐性检验。p－JAK2、p－STAT3蛋白表达灰度值及凋亡细胞数三组间比较采用方差分析，三组间两两比较用LSD－t检验。脑缺血再灌注组与治疗组两组间大鼠脑梗死体积比较采用两组独立样本t检验，神经缺损评分比较采用Mann－Whitney U检验。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经功能评分 假手术组大鼠未出现神经功能缺损症状，脑缺血再灌注组大鼠出现不同程度的肢体活动障碍，精神状态差，进食及活动均减少。脑缺血再灌注组及治疗组大鼠于再灌注后的24h、48h神经功能缺损评分差异无统计学意义，故计录24h时神经功能评分。与脑缺血再灌注组比较，治疗组神经功能评分降低（P＜0.01）（表1），精神状态、进食及活动均较用药前好转。

2.2 大鼠脑梗死体积测定 假手术组大鼠未见脑梗死灶，脑缺血再灌注组和治疗组大鼠右侧大脑中动脉供血区的部分大脑皮质、纹状体可见明显梗死灶（图1），治疗组脑梗死体积与脑缺血再灌注组比较明显缩小（P＜0.01）（表1）。

图1 脑缺血再灌注组（A）及治疗组（B）大鼠脑梗死灶（图中箭头所示）比较（TTC染色）

2.3 各组脑组织中p－JAK2与p－STAT3蛋白表达 假手术组偶见 p－JAK2、p－STAT3蛋白阳性细胞；与假手术组相比，脑缺血再灌注组和治疗组p－JAK2和p－STAT3蛋白阳性细胞增多，治疗组p－JAK2和p－STAT3蛋白阳性细胞较脑缺血再灌注组明显减少（图2）。三组大鼠脑组织中p－JAK2及p－STAT3蛋白表达灰度值差异有统计学意义（P＜0.01）；与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠脑组织内p－JAK2及p－STAT3蛋白表达灰度值明显减低（P＜0.01）；与缺血再灌注组相比，治疗组大鼠脑组织内p－JAK2及p－STAT3蛋白表达灰度值明显增高（P＜0.01）（表1）。

表1 各组大鼠各项指标比较 （n＝6，）

表1 各组大鼠各项指标比较 （n＝6，）

注:与假手术组比较，＊P＜0.01；与缺血再灌注组比较，＃P＜0.01

组别 神经功能评分 脑梗死体积（%） P－JAK2阳性细胞 p－STAT3阳性细胞 凋亡细胞比例（%）治疗组 1.45±0.51＃ 16.27±1.44＃ 36.47±6.38＊＃ 35.87±5.52＊＃ 27.84±2.69＊＃脑缺血再灌注组 2.72±0.45 28.65±1.36 25.62±6.25＊ 24.52±5.08＊ 39.51±3.74＊假手术组0 0 41.59±6.43 43.36±5.68 6.02±1.34

图2 各组大鼠脑组织p－JAK2、p－STST3蛋白阳性表达（免疫组化×250）及细胞凋亡（TUNEL法×250）情况:三组图中箭头所示由上至下依次分别p－JAK2阳性细胞、p－STAT3阳性细胞及凋亡细胞

2.4 各组脑组织细胞凋亡比较 假手术组大鼠脑组织中偶见凋亡细胞，脑缺血再灌注组凋亡细胞比例与假手术组比较明显增多（P＜0.01），治疗组凋亡细胞与脑缺血再灌注组比较明显减小（P＜0.01）（表1、图2）。

3 讨论

JAKS－STATS通路与缺血时神经细胞存亡有着密切联系，当脑组织缺血时即可激活该通路，许多细胞因子（如IL－6、CNTF等）和生长因子（如EGF、CSF等）及氧化应激也都利用JAK／STAT信号转导通路诱导细胞的增殖、分化或凋亡。有研究表明缺血再灌注过程中P－STAT3表达显著增加，并且随着缺血再灌注时间延长而增加，于再灌注24h时可能达到峰值［5］，其激活程度可能与缺血面积大小密切相关；另有研究表明JAK2－STAT3信号转导通路还直接参与了缺血再灌注后炎性反应的发生，当脑缺血再灌注损伤后，p－JAK2及p－STAT3蛋白表达在缺血半暗带区明显增强，并促进了神经细胞凋亡［6］。

近年来国内外一些学者对rhG－CSF在缺血再灌注动物模型治疗方面的研究发现，它可以动员骨髓干细胞向缺血区迁徙，促进新生血管生成与神经的增殖分化，同时可以抗炎、抗凋亡。Solaroglu等［7］认为rhG－CSF在局灶性脑缺血中可能通过抑制神经元与胶质细胞炎性细胞因子表达起到抗炎作用，通过cLap2抗凋亡蛋白起到抗凋亡作用。Jiang等［8］的研究表明rhG－CSF可明显降低IL－1β、TNF－α等因子的表达，从而减轻AD小鼠大脑的炎性反应，起到神经保护作用。上述研究均表明rhG－CSF具有抗炎、抗凋亡、神经营养和保护作用，可以减少脑组织梗死体积，改善神经功能缺损症状。其可能机制为rhG－CSF通过降低相关细胞因子，如IL－6的表达使JAK2多聚泛素化，JAK2被降解，并进一步阻碍STAT3的活化，减少炎性反应的发生，同时减少中性粒细胞激活和浸润、细胞毒性，减少炎性反应［9－10］，从而起到神经保护作用，但其具体抗炎、抗凋亡机制尚不清楚，仍需进一步研究。

该研究结果显示:假手术组大鼠神经功能无缺损，脑组织未见梗死区域，偶见p－JAK2、p－STAT3阳性细胞表达及凋亡细胞；与脑缺血再灌注组相比，治疗组大鼠神经功能得到改善，脑梗死体积减小，脑组织p－JAK2、p－STAT3蛋白表达减弱，凋亡细胞数也明显减少，提示rhG－CSF可能通过抑制JAK－STAT信号转导通路的活化，减轻炎性反应，使凋亡细胞数减少，而起到神经保护作用，但具体抗炎机制不清楚，仍需进一步研究。

综上所述，rhG－CSF可能通过抑制炎性细胞因子介导JAK2／STAT3信号转导发挥神经保护作用，这可能是rhG－CSF对脑缺血再灌注损伤神经保护的作用机制之一，为rhG－CSF的临床应用提供了新思路，但rhG－CSF是否还通过其他途径影响细胞凋亡还需进一步研究。

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