受试者工作特征曲线评价帕金森病小鼠模型血浆生化指标的变化

陈敏 张家义 陈丽红 卢昕 于顺 于兰 刘承伟

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种与老化密切相关的神经退行性疾病，黑质多巴胺（DA）能神经元大量变性丢失和路易小体（Lewy body，LB）形成为其特征性病理改变［1］。早期诊断对疾病治疗和病情监测至关重要，寻找适合于早期诊断的生物标记（biomarker）具有重要意义。血液的易获取性使其成为研究生物学标记物的首选对象［2］。氧化应激是神经变性疾病血液生化集中研究的方向［3］，8－羟基脱氧鸟嘌呤（8－OHdG）、谷胱甘肽、尿酸（UA）［4－5］，以及 DA 及其代谢产物含量被认为是反映DA能神经元变性程度的有效生化指标［6］。表皮生长因子（EGF）能促进间充质干细胞向DA能神经元转化及再生［7］。目前建立PD小鼠模型大多使用短时间、大剂量单一注射神经毒素1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（MPTP）的方法，该处理与PD多因素共同作用致病存在较大差异而不能真实模拟PD渐进发展的病理过程。有文献报道丙磺舒与MPTP联合用药造模比单用MPTP有明显优势［8］。本实验在此基础上在加入年龄和给药时间因素运用正交设计可能进一步真实地模拟PD自然发病过程，应用受试者工作特征曲线（ROC曲线）选择具有较高评估效度的指标并分析其与DA能神经元缺失水平的关系，评价这些指标成为生物学标记物的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:健康雄性 C57BL／6j小鼠50只，体质量（25±2）g，购自北京维通利华公司。饲养条件:桂林医学院SPF级实验动物饲养室，单笼饲养，自由取食进水，室温（24±2）℃，湿度40%，14h光照10h黑夜。

1.1.2 主要试剂:MPTP、丙磺舒购自Sigma公司，兔抗鼠酪氨酸羟化酶（TH）抗体购自Assay生物公司，10%（质量浓度）水合氯醛由桂林医学院附属医院药剂科提供，多聚甲醛购自成都科龙化工公司；抗兔二抗、山羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司，UA测定试剂盒购自南京建成生化试剂公司，小鼠EGF ELISA试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，其余试剂均为国产分析纯产品。

1.2 方法 小鼠适应环境1周后随机分为10组〔其中9个实验组（A～I），1个空白对照组（J）〕，每组5只，按正交设计进行编组。将不同浓度丙磺舒按0.5mL／100g腹腔注射，终浓度分别为按体质量200mg／kg、100mg／kg、50mg／kg。30min后背部皮下注射不同剂量MPTP，终浓度分别为按体质量20mg／kg、10mg／kg、5mg／kg。腹腔注射与皮下注射均为2次／周。具体实施方案见表1。

表1 正交设计分组实施方案表

1.2.1 血浆生化指标检测:用10%（质量浓度）水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，含肝素抗凝管收集血液样本，以3000r／min，4℃低温离心10min（离心半径16cm），取上清液－80°冰箱保存。采用高效液相色谱法检测DA与8－OHdG水平；以ELISA法检测血浆中EGF、UA水平，用酶标仪（LP－40，法国DIAGNOSTICS PASTEUR）检测，具体操作参照试剂盒说明书。

1.2.2 TH免疫组化染色及TH阳性细胞计数:动物麻醉取血后用4%（质量浓度）多聚甲醛溶液经左心灌注固定后，完整取出脑组织，于4%（质量浓度）多聚甲醛中后固定24h。以视交叉前缘和乳头体后缘为标志，显微镜下连续1mm冠状位取脑组织至中脑黑质，石蜡包埋后制成厚4μm切片，隔5取1，每个标本取5张切片。石蜡切片经脱蜡、内源性过氧化物酶处理、抗原修复以及正常山羊血清封闭处理后，与兔抗鼠TH抗体（1∶200）4℃反应过夜，生物素化山羊抗鼠IgG（1∶1000）室温反应2h，链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶（1∶1000）反应1h，DAB显色液显色，苏木素复染5min，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。光学显微镜下观察黑质区TH免疫反应阳性神经元表达情况。TH阳性神经元计数越高，表明DA能神经元缺失越严重。每张切片随机取5个高倍视野（HP），应用Image－Pro Plus 6.0分析中脑黑质图像，计数TH免疫反应阳性神经元数量；分析该神经元数量与血浆中DA、8－OHdG、UA和EGF水平之间的相关性。将各组生化指标以空白对照组J为参照，应用ROC曲线选择评估效度较高的指标，评价其成为PD生物学标记物的可能性。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0for Windows软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示；相关性分析采用Spearman检验；指标评估效度检验采用ROC曲线分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TH免疫反应阳性神经元 不同实验组TH免疫反应阳性神经元出现不同程度减少，密度不同（图1），具体结果见表2。

2.2 TH阳性神经元计数及其与血浆生物指标的相关性分析 各指标检测结果见表2。EGF水平与TH阳性神经元数呈正相关（r＝0.681，P＝0.000），8－OHdG水平与TH阳性神经元计数呈负相关（r＝－0.674，P＝0.000），UA 和 DA 水平与TH 计数无相关性 （r＝0.229，P＝0.110；r＝0.065，P＝0.654）。

2.3 ROC曲线评估 EGF与8－OHdG在评估小鼠模型PD的DA能神经元缺失水平具有一定准确性，其 AUC值均为0.82，均P＝0.000；UA和DA的AUC值分别为0.55和0.53，P值分别为0.552和0.772。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性，具体结果见图2。

图1 各组黑质TH阳性神经元情况（免疫组织化学染色×400）

表2 血浆生化指标与TH计数结果 （，n＝5）

表2 血浆生化指标与TH计数结果 （，n＝5）

组别DA（μg／mL）8－OHdG（μg／mL）UA（μmol／L）EGF（pg／mL）TH阳性神经元计数（个／HP）A 0.3±0.2 0.4±0.2 137.4±31.4 741.8±174.4 45.2±7.6 B 0.3±0.2 0.8±0.4 126.6±58.1 884.4±221.8 26.0±7.6 C 0.3±0.2 1.1±0.3 66.8± 7.9 568.4± 99.4 9.8±2.4 D 0.4±0.3 0.9±0.3 143.4±45.2 781.4±199.5 20.6±5.6 E 0.3±0.3 0.4±0.1 68.6± 3.4 1141.0±303.7 45.4±6.7 F 0.3±0.1 0.9±0.2 140.1±36.2 756.2±103.3 21.2±5.4 G 0.3±0.3 0.8±0.4 182.8±29.5 878.2±233.5 26.0±9.8 H 0.2±0.2 0.9±0.3 102.0± 9.4 772.2±191.1 21.0±7.1 I 0.4±0.3 0.4±0.1 73.6± 7.5 1222.6±281.6 43.6±8.7对照组 0.4±0.2 0.5±0.2 272.4±37.0 1202.6±358.1 49.4±5.4

图2 全部小鼠的生化指标ROC曲线

3 讨论

理想的PD生物标记物是能够反映PD病理改变、病程发展特征的客观指标，包括生化指标、影像学指标和蛋白组学指标等。由于血液的易获取性，从血液当中找到PD确实稳定的生物学标记物是当前研究的热点。由于PD病理成因复杂以及关联因素多，而目前多数PD生物学标记物的实验研究是基于单一条件建立的动物模型，因而由此获得的生物样本也难以成为理想的诊断标记物。本实验选取PD具有代表性的影响因素，如动物年龄、给药时间和剂量等的不同水平，采用正交设计做不同组合，所获得的数据可能更能反映各种不同因素的相互作用引起的血液生物化学物质的变化与脑内病理变化的相互关系；结合相关性分析与ROC曲线结合统计分析，可能使上述变化更具有反映脑内病理变化，尤其是DA能神经元缺失的价值［9］。

DNA中碱基鸟嘌呤易受羟自由基攻击而形成碱基修饰产物8－OHdG，其在血浆中水平相对稳定［10］，是目前公认的内源性及外源性因素所致DNA氧化损伤的生物标志物，是反映DNA氧化损伤灵敏且稳定的指标［11］。本实验结果显示，血浆8－OHdG水平与TH免疫阳性神经元数量呈负相关（r＝－0.674，P＝0.000），ROC曲线评估其AUC值为0.82，在ROC图像靠近左上角，表明其具有较高诊断准确性，提示8－OHdG有可能作为PD早期诊断的血浆生物学标志物。

黑质中富含的EGF，是结合酪氨酸激酶受体进行调节细胞生长和分化的蛋白多肽［12］。在神经系统损伤时EGF对受损神经元起营养和保护作用。本实验中血浆EGF水平与TH免疫阳性神经元数量具有正相关性（r＝0.681，P＝0.000），随着TH阳性神经元大量变性缺失，EGF水平相应降低，与文献报道［13］的结果一致。ROC曲线评估其AUC值为0.82，表明有较高评估效度，提示血浆EGF有可能作为PD外周血诊断标记物。血浆EGF水平变化与黑质TH阳性细胞数量（TH阳性神经元数量越多表明DA能神经元缺失越严重）之间关系的机制尚不清楚。本实验中，PD模型采用MPTP建立，后者除破坏DA能神经元之外，其毒性也影响成神经细胞的迁移进而在一定程度上减少神经元再生［14］，可能影响EGF分泌及其向血液中释放而导致EGF水平下降。

本实验结果显示血浆中神经递质DA水平与黑质TH阳性神经元数无相关性（r＝0.229，P＝0.110），其可能原因为，慢性小剂量注射 MPTP对DA能神经元造成的伤害尚不足以导致血中DA水平降低，或未损伤的DA能神经元代偿性增加DA的合成与分泌，致使血中DA水平在短时间内并不降低［15］。

UA具有抗氧化作用，是PD的保护性因子［16］，血UA水平低是PD的可能危险因素之一，本实验当中所用丙磺舒能够抑制尿酸盐在近曲肾小管的主动再吸收，增加尿酸盐排泄而降低血中尿酸盐水平，可能是造成实验中血浆UA水平进一步下降的原因。

PD是中老年人常见的神经系统退行性疾病，60岁以上中老年人群中患病率高达1%～2%，年龄老化倾向于被认为是大多数散发性PD发生的基础背景，因此，作者改变以往多应用8周龄青年小鼠的造模动物，而以年龄差异作为变量之一建立模型，由此获得的数据可能较以往的研究更具有说服力。本实验结果显示血浆中8－OHdG和EGF水平与黑质DA能神经元缺失水平有相关性，并具有一定的评估效度，在后续研究中仍需继续探讨在老龄鼠模型中上述指标的变化。

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