乙型肝炎病毒基因分型的临床意义及基因分型方法

彭锐综述，张洪审校（武汉大学人民医院药学部，武汉 430060）

我国是乙型肝炎病毒（HBV）感染的大国，据研究表明全球有3.5亿HBV 携带者，我国占三分之一，每年发病率达6000万人次以上。不同HBV DNA 基因型之间存在着致病性的差异，因此，HBV 基因分型对快速了解患者感染病毒状况具有十分重要的作用。HBV 属于嗜肝DNA 病毒科，部分双链环形DNA 病毒，基因组长约3.2kb，基因组中包含4个开放区：前S／S、前C／C、X和P区［1］。由于缺乏校对功能的酶，HBVDNA复制过程容易发生碱基错配，从而发生基因突变形成不同基因型。

1 HBV 基因多态性

1.1 地域分布目前根据全基因序列异质性大于或等于8%，将HBV 基因型分为A～J 10种不同类型，并且每种基因型分布存在地域差异现象［2］。基因型A 包含A1～A7七种亚型；B型有B1～B9九种亚型；基因型C有12种亚型C1～C12；D型有8种亚型D1～D8；基因型F 只有4种亚型F1～F4；其他基因型目前还未发现亚型存在。有关HBV 基因型研究表明，B和C 基因型主要分布在亚洲；而欧洲最常见的基因型是A 和D型［3］。雷延昌等［4］研究湖北省190例HBV DNA 阳性血清标本研究发现，B基因型140例（73.7%），C 基因型42例（22.1%），BC混合型8例（4.2%），未发现A、D 和E 基因型；新疆地区B型占5.56%，C 基因型也占据5.56%，BC 杂合型有22.22%，而D 基因型高达66.67%。说明HBV 基因型在我国的地域分布存在明显差异，见表1。

1.2 HBV 基因型与肝病演化的关系研究表明基因B型通常引发轻微肝纤维化；C型易引起侵害性的严重肝脏疾病，可发展为肝硬化和肝癌；A 基因型携带者比D 基因型更易发展为慢性肝炎，D 基因容易诱导急性肝炎［5］。因此，临床治疗前HBV DNA 基因型检测具有十分重要的作用，对临床抗病毒治疗方法的选择、预后判断都有指导意义。

1.3 慢性乙型肝炎（CHB）CHB表现出明显的地域分布多态性，在亚洲和非洲发病概率较高，而在北美和欧洲发病概率相对较低。目前，世界上超过3.5亿人是HBV 慢性感染者，60%肝癌患者通过CHB 演化而来。CHB 感染者乙型肝炎表面抗原（HBsAg）比健康个体含量高1.5%。HBV 存在多种传播途径，包括输血、子宫内、性关系、家族之间和医院内传播等［6］。HBV 感染后的临床治疗结果高度可变，遗传和环境因素对肝脏疾病的进展起着重要的调节作用。人口统计学变量阐述了感染者的年龄、性别、生活习惯、伴随疾病（如慢性酒精疾病、其他肝病毒感染等）都会影响HBV持续性感染［7－9］。CHB会发展为其他肝脏疾病，像肝纤维化、肝硬化和肝癌等，紧密依赖于与疾病相关基因型。

表1 中国部分省份HBV 基因型分布差异

1.4 HBV 基因型对药物使用的影响 HBV 基因突变会产生病毒耐药现象，比如：拉米呋定是抗HBV 治疗的一线药物，耐药的主要机制是HBV－DNA 聚合酶基因突变引发病毒DNA与药物的结合力减弱，主要是rtL180M＋rtM204V 和rtM204I突变。另外一个研究说明，阿德福韦耐药菌株的位点是rtN236Tand rtA181［10］。HBV 基因C型患者比B型基因突变更易产生耐药性，但是其机制并没有完全阐明。可能是由于不同HBV 基因型结构差异编码出不同蛋白质，以至于对拉米呋定产生了不同耐药反应。另一原因也许是在服用拉米呋定后，基因C型相对基因D型更容易出现YMDD 突变［11］。所以更应注意对基因C型乙型肝炎患者的关注，无论在抗病毒治疗过程还是对常见耐药位点的监测。对长期服用核苷酸类似药物的患者，对耐药突变和基因检测显得尤为重要，有助于了解不同基因型乙型肝炎患者相关耐药基因，帮助选择抗病毒药物、对个体化抗病毒治疗提供科学依据［12］。HBV 基因型差异对干扰素的反应也存在区别，干扰素对基因B型和C型的患者治疗效果更好；基因D型比混合基因型有更好的治疗效果。主要是因为HBV 基因C 区启动子C 遗传变异的分子特征决定。携带基因A型患者对干扰素治疗效果较好，因为HBV 基因C区容易发生启动子突变和更少核衣壳蛋白变异。而且前C区终止密码子突变会导致干扰素疗效的下降。

2 HBV－DNA 基因型检测

HBV 耐药基因突变和基因型检测对指导临床治疗具有潜在价值，寻找一种适合临床检测的方法非常必要。研究表明，近年来许多方法用于检测HBV 耐药基因和进行基因分型。比如基于测序的方法［克隆测序和聚合酶链反应（PCR）产物直接测序］；限制性片段长度多态性（RFLP）［13－14］；PCR 特异性引物测序；基于杂交的方法［寡核苷酸芯片、INNO－LiPA 分型和PCR 微型板块杂交－酶联免疫吸附（ELISA）技术］等。

2.1 PCR 产物直接测序方法此方法主要包括HBV－DNA全基因测序和S基因测序，直接测序方法是目前临床上最常见的检测方法，通过测序来检测病毒基因型和直观的变异，是HBV 基因型检测的金标准，但是存在许多缺陷，如操作繁琐、耗时、高成本和较难改进等，而且只能检测出突变大于或等于20%的基因型。有关研究说明，S基因测序与全基因测序有着同样的准确性，HBV－NA S基因区由S基因、前S1基因和前S2基因组成，它们能够分别编码HBsAg的小蛋白、大蛋白和中间蛋白。但是S基因测序也是种昂贵、耗劳动力的方法，不适合大范围临床和流行病学研究工作。

2.2 PCR－RFLP 此方法是结合PCR 技术和RFLP技术，使来源于PCR 扩增的目的片段在合适的限制性内切酶水解作用后，通过琼脂糖凝胶电泳，不同的基因型片段呈现出不同长度的条带［15］，从而加以区分，是临床上一种有效的检测方法。

2.3 INNO－LiPA 分型和寡核苷酸芯片法

2.3.1 INNO－LiPA 分型作用原理为生物素标记的HBVDNA 扩增产物与以平行方式固定在尼龙膜上的寡核苷酸探针杂交，未杂交的DNA 被冲洗掉；然后，加入的碱性磷酸酶标记的链霉菌亲和素与生物素标记的杂交产物结合；最后，将BCIP／NBT 加入到尼龙膜上观察颜色的变化。

2.3.2 寡核苷酸芯片法此法是基于反相杂交的原理，使Cy5标记的扩增子与固定在微板上的特异性类型寡核苷酸杂交。

2.4 PCR 微型板块杂交－ELISA技术PCR提取血清样品中HBV－DNA，然后与两个特异性探针杂交。其中一个探针用于捕获HBV－DNA，另一种是5′端生物素标记的基因分型探针。此技术灵敏性和特异性和S基因直接测序法相同，可适用于大范围的临床检测和流行病学研究。

2.5 微阵列它是基于杂交的一种方法，能同时检测多个样品。但是其灵敏性并不高，因此相关研究通过增强信号的方法解决此问题。采用两种信号增强的办法来增加微阵列DNA的荧光信号强度，即多标记侧链引物和多检测点引物。前种方法是同时增加特异性扩增的靶标产物荧光标记分子的数量；后者是增加每个杂交位置可检测的荧光分子。

2.6 HiSeq测序上述方法在操作过程都存在各种缺陷，因此Han等［16］改进成新技术HiSeq测序。此测序首先将经过剪切的DNA 片段两端加上接头并通过碱基互补结合固定在芯片表面，使用引物扩增后将双链变性为单链后该单链的一端就固定在芯片上，另一游离端可随机与附近另外一个引物互补结合，也被固定形成一个桥。用引物PCR 后每个DNA 片段大约获得1000倍扩增，形成单克隆的DNA 簇群。HiSeq测序对HBV 基因型的检测有较高的灵敏性、精确性、高通量和自动化，是检测HBV DNA 基因突变和分型的好方法。桥式PCR的设计采用一个引物连接标记序列的末端。在PCR 循环反应中，桥式引物将标记片段串联起来，是一种能高通量的将标记序列进行简单、有效的扩增。

3 结论

HBV 基因型呈现出明显的域分布差异，研究不同基因型间的不同致病性对疾病演进、传播方法和抗病毒的治疗有着重要的意义。即使现在HBV－DNA 检测技术和分型方法得到了改进，但是一种更适合大样本基因型分析和低成本、低耗时的方法还有待探索。希望通过不断探索，将这些成果运用到HBV 预防、治疗和乙型肝炎患者临床类型检测，实现真正的个体化用药。

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