COX-2抑制剂对人舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞COX-2和Ang-1基因表达的影响

王晓彦，武云霞

(1深圳市龙岗中心医院耳鼻咽喉分院口腔科，深圳 518172;2山西医科大学第一临床医学院口腔科)

血管形成在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，实体瘤的生长需要血管提供氧气和营养，没有血管生成，原发肿瘤不会超过1－2 mm3［1］。近年来研究表明COX-2与多种肿瘤的部位及病理学分级无关，而与肿瘤的浸润、淋巴结转移和预后不良有关，提示COX-2在肿瘤的发生、发展和转移中有重要的生理功能［2］，并参与实体肿瘤的血管生成［3，4］，但其机制尚不完全明确。本试验通过研究COX-2抑制剂尼美舒利 NIM(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)对人舌鳞癌Tca-8113细胞中COX-2、Ang-1基因表达的影响以探讨其抗血管生成的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人舌鳞状细胞癌细胞株Tca－8113购自中科院上海细胞生物研究所，培养于含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI1640培养液的培养瓶中，0.25%的胰蛋白酶消化传代，RNA抽提试剂盒W6221(上海华舜生物工程有限公司)，随机引物、RNase抑制剂、dNTP AMV逆转录酶和TaqDNA酶(均为 Fermentas公司)，COX-2、Ang-1和 GAPDH引物(上海生工生物工程公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 分组 Tca-8113对数生长期细胞数量至1×106/ml接种于培养瓶中，24 h后换液。NIM处理组浓度为25，50，100 和200 μmol/L;对照组含0.4%的等量二甲基亚砜。培养48 h后收集细胞，各组均重复3瓶。

1.2.2 RT-PCR检测Ang-1基因的表达 按 RNA抽提试剂盒W6221说明书提取细胞总RNA，测定RNA纯度并定量。cDNA过程为:总RNA 2μl、随机引物1μl，DEPC水补至终体积12μl，混匀，离心3－5 s，70 ℃变性 5 min，冰上冷却 3－5 min，离心3－5 s，冰上冷却3－5 min，依次加入5倍缓冲液4 μl、RNase抑制剂 1 μl、10 mmol/L dNTP 混合液 2 μl，混匀，25℃温浴5 min，加入 AMV逆转录酶1 μl，25 ℃10 min，42 ℃60 min，72 ℃10 min终止反应后置于冰上。

PCR扩增体系为10倍缓冲液2.5μl、25 mmol/L MgCl24μl、10mmol/L dNTP 混合液1μl、50μmol/L上下游引物(引物序列见表1)各0.5μl、cDNA模板10μl、TaqDNA 酶2μl、双蒸水补终体积至 50 ml。10μl的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭显色，目的条带用图像分析系统作光密度测定，以COX-2、Ang-1光密度值分别与GAPDH光密度值之比值作为其mRNA相对含量。

表1 不同基因引物序列及大小Table 1 Gene primer sequences

1.3 统计学分析

2 结果

NIM各处理组与对照组之间COX-2、Ang-1 mRNA表达进行比较，差异有统计学意义(P＜0.01，见表2)。Tca-8113细胞经过后可在Tca-8113细胞中检测到COX-2和Ang-1 mRNA表达显著下降(见图1)。Pearson相关性显示，COX-2 mRNA表达与NIM浓度之间有相关性(r=－0.963，P＜0.01)，Ang-1mRNA表达与NIM浓度之间也呈负相关(r=－0.988，P＜0.01)，表明 NIM 的抑制作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性。

表2 Tca-8113细胞中COX-2 mRNA和Ang-1 mRNA表达定量分析(±s，n=3)Table 2 Quantity analysis of expression of COX-2 mRNA and Ang-1 mRNA in Tca-8113 cells(±s，n=3)

表2 Tca-8113细胞中COX-2 mRNA和Ang-1 mRNA表达定量分析(±s，n=3)Table 2 Quantity analysis of expression of COX-2 mRNA and Ang-1 mRNA in Tca-8113 cells(±s，n=3)

与对照组比较，a F=151.778，a P＜0.01;与对照组比较，b F=232.384，b P＜0.01

NIM 50 μmol/L 0.577 9±0.026 5a 0.503 8±0.027 1b NIM 100 μmol/L 0.500 8±0.011 5a 0.322 4±0.018 0b NIM 200 μmol/L 0.290 8±0.021 4a 0.196 6±0.002 5b

图1 Tca-8113细胞GAPDH、COX-2、Ang-1 mRNA表达的RT-PCR结果Figure 1 RT-PCR analysis results of GAPDH，COX-2 mRMA and Ang-1 mRNA

3 讨论

自从1954年Algire提出肿瘤血管形成概念以来，人们就逐渐认识到肿瘤是由肿瘤细胞和血管两部分有机地组成。肿瘤条件下的血管生成是一持续、无控性的过程［5］。血管形成在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，肿瘤的血管生成是由促进和抑制血管生成因子之间的不平衡造成的，在这些促进血管生成的因子之中，目前研究得最多的就是血管生成素(angiogenins，Angs)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。

血管生成素共有4名家族成员，分别为Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4，其中对 Ang-1和 Ang-2的研究比较多。Ang-1基因位于染色体8q22，是Tie-2的激活剂，主要由血管旁细胞包括周细胞、血管平滑肌细胞和肿瘤细胞表达。Ang-1表达及其作用要晚于Ang-2及VEGF，Ang-1具有吸引血管周细胞和内皮平滑肌细胞聚集并相互作用，增强血管内皮细胞间连接从而有利于维持血管壁完整，促进血管重塑、稳定血管、防止渗漏的作用［6］。Wurmbach 等［7］用免疫组化检测Ang-1/Tie-2在前列腺癌中的表达，发现Tie-2表达于肿瘤性血管内皮细胞，Ang-1表达于腺样肿瘤细胞，瘤组织周围大量血管生成，推测Ang-1/Tie-2以旁分泌的方式诱导癌组织的血管生成。有研究表明肿瘤中存在自分泌机制，即由肿瘤细胞分泌的Ang-1在以旁分泌方式促进肿瘤血管生成的同时，还可能以自分泌方式作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞的增殖和凋亡产生影响［8］。Park等［9］通过对早期肺癌切除的患者研究认为，Ang-1血清水平可作为术后预后指标。其促进肿瘤血管生成的机制可能有以下几个方面:①抑制内皮细胞凋亡;②介导血管内皮细胞与血管旁细胞间的相互作用;③抑制肿瘤细胞凋亡。

COX-2表达是口腔肿瘤发生的早期事件，提示其可能在口腔肿瘤的发生发展中起作用［10］。研究发现，COX-2抑制剂能降低结肠癌的发病率，其机制主要是诱导细胞凋亡、调控细胞周期、影响肿瘤新生血管生成等［11］。Fu 等［12］通过反义 COX-2 mRNA转染胃癌细胞株发现抑制COX-2的表达能部分逆转癌细胞增殖和迁移，治疗胃癌过程中发现COX-2抑制剂在抑制肿瘤新生血管生成中起着重要作用。

在本研究中，人舌鳞癌Tca-8113细胞经过不同浓度COX-2抑制剂NIM处理后，COX-2和Ang-1基因在细胞中表达明显下降，且表达下降程度呈浓度依赖性，两者下降呈正相关。这提示NIM可以抑制COX-2的活性，药物浓度加大抑制程度增加，同时Ang-1基因表达也随着药物浓度增加被抑制程度增加。说明NIM是通过COX-2途径下调Ang-1基因表达，推断通过COX-2抑制剂阻断COX-2表达可使得Ang-1基因表达降低，从而阻断肿瘤血管的生成。

近年来，COX-2已成为一些肿瘤防治的新靶点。NIM可通过抑制COX-2来抑制肿瘤生成，因而其不仅可用于肿瘤的化学预防，还很有可能用于临床治疗。未来需要进一步确定NIM用于人类口腔肿瘤化学预防和治疗的剂量、时间及适宜的人群，为预防头颈部肿瘤发生及抗肿瘤治疗提供切实可行的方案;其次，积极开发新的选择性COX-2抑制剂，有望成为肿瘤的临床治疗的辅助手段之一。

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