DHA对小鼠急性肺损伤的保护作用及可能的机制研究

史红阳，李满祥，刘 昀，方 萍，和 平，张德信

(西安交通大学第二附属医院呼吸内科，西安 710004)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全［1］。其具体的病理机制包括炎症反应与抗炎反应的失衡，氧化反应与抗氧化反应的失衡，进而导致了一系列的病理改变［2］。尽管有多项研究及临床试验，但是目前尚无有效的干预措施，ALI死亡率极高［3］。因此急需寻找有效的治疗药物或者新的方法治疗急性肺损伤。

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)是人体所必需的一种omega－3多不饱和脂肪酸，来源于鱼油和微藻油，对人体生理功能的正常发挥及多种疾病的防治有着重要作用。近年来多项研究证明摄入DHA可发挥显著的抗氧化、抗炎及免疫调节的作用，能显著缓解相关动物模型疾病［4－7］。提示DHA对相关疾病的发病机制具有抑制作用。尚未发现DHA对LPS诱导的急性肺损伤的相关保护作用。本研究旨在探索DHA是否具有抑制LPS诱导的急性肺损伤发病的作用，并且进一步研究DHA改善LPS诱导小鼠急性肺损伤的潜在机制，以期为急性肺损伤的治疗提供新的方式和策略。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

BALB/c小鼠由西安交通大学医学部动物实验中心提供。二十二碳六烯酸和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Escherichia coli 055:B5)购于美国 Sigma－Aldrich公司。髓过氧化物酶(MPO)测试盒购于南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6、IL-10检测试剂盒为R＆D Systems ELISA试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制作和实验分组 6－8周龄BALB/c小鼠(20－25 g)18只随机分3组:①对照组，气管内滴注PBS;②LPS模型组，气管内滴注LPS(100 μg/50μl)，作用6h;③DHA组，连续给予DHA(500 mg/kg)灌胃连续预处理7 d［5］，再气管内滴注 LPS(100μg/50μl)作用6 h;小鼠均在西安交通大学医学部动物中心SPF级动物房饲养，LPS气道滴注6 h后处死小鼠。

1.2.2 收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)LPS作用6 h后处死小鼠，利用气管内注射的方式收集BALF，利用0.8 ml预冷的PBS进行支气管肺泡灌洗，每只小鼠灌洗3次，BALF的回收率超过85%。BALF在4℃、1 000×g，离心5 min。分别收集沉淀和上清，BALF上清液在－80℃保存备用。离心后的细胞沉淀用PBS重新悬浮，利用细胞计数板进行白细胞计数。

1.2.3 肺组织病理学检查 取完整的左肺组织在10%中性缓冲福尔马林溶液中固48 h，常规石蜡包埋、切片，苏木精－伊红染色。显微镜下观察肺组织病理学变化。

1.2.4 肺泡灌洗液中 IL-1β、IL-6、IL-10 浓度检测支气管肺泡灌洗液上清中IL-1β、IL-6、IL-10的浓度利用ELISA检测，操作步骤按照试剂盒说明进行。

1.2.5 髓过氧化物酶(MPO)活性检测 总 MPO活性是中性粒细胞功能标志和启动标志，肺组织内中性粒细胞大量聚集可导致MPO活性明显升高。称取一定量肺组织，加入5倍体积预冷的生理盐水，利用超声法制作组织匀浆，利用MPO测定试剂盒在460 nm波长处进行比色测定，从而推算出MPO的活力，反映炎症的严重程度。

2 结果

2.1 DHA对肺组织病理改变的影响

与对照组相比，气道内滴注LPS6h后，肺泡腔及间质内大量出血，肺泡间隔水肿增厚，大量炎症细胞浸润，部分肺泡腔不张，肺组织形态结构被完全破坏，而应用DHA预处理后上述病理改变明显减轻(图1，见第667 页)。

2.2 DHA对小鼠肺组织浸润炎症细胞数的影响

如图2所示，与对照组相比，气道内滴注LPS6h后，BALF中的炎症细胞数显著升高(P＜0.01)，与之相伴随的是肺组织内代表中性粒细胞聚集数目的MPO活性显著升高(P＜0.01)，而应用DHA连续预处理小鼠7 d后，上述改变被显著抑制。

2.3 DHA对小鼠肺组织分泌细胞因子的影响

如图3所示，气道内滴注LPS6h后，BALF中IL-1β、IL-6的浓度与对照组相比显著升高(P＜0.01)，保护性细胞因子IL-10较对照组有所升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)。而应用DHA连续灌胃预处理小鼠7 d后，BALF中IL-1β、IL-6浓度显著下降，保护性细胞因子IL-10显著升高，与LPS模型组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

当机体遭遇各种炎性刺激(如LPS)后，可释放各类炎性介质(如IL-1β、IL-6等促炎性细胞因子)，促进组织水肿和损伤［8，9］。而药物干预上述促炎性细胞因子的分泌可显著改善动物模型肺损伤［8－10］。本研究中得出了相同的结论，在LPS干预组小鼠IL-1β、IL-6显著升高，同时BALF中的白细胞数目也明显升高，而DHA预处理后可显著抑制白细胞的浸润及促炎细胞因子的分泌，提示DHA预处理可显著抑制LPS诱导小鼠急性肺损伤组织病理改变。同时本研究提示DHA预处理可显著减轻LPS诱导小鼠急性肺损伤炎症细胞的浸润。

IL-10作为人体内重要的抗炎因子，可抑制炎性反应，重建抗炎反应和炎症反应的平衡，如抗炎因子分泌量少，不足以对抗炎性因子所导致的炎症反应，则会导致炎症细胞大量浸润、组织水肿、器官功能损害，并增加患者的死亡率。研究发现，因ARDS死亡患者的疾病初期，其肺泡灌洗液中的IL-10浓度较低，推测IL-10不足可能是导致促炎因子生成增多以及肺内炎症反应加剧的原因之一［11，12］。进一步研究发现吸入IL-10可显著抑制TNF-α、IL－1β及IL-6的分泌从而对急性肺损伤动物模型发挥保护作用［13，14］。在本研究中DHA预处理显著促进了IL-10的分泌，改善了急性肺损伤。

既往研究发现DHA可通过多种机制抑制疾病的发生发展。Camuesco等［15］研究发现 DHA可通过抑制TNF-α、IL-1β的分泌及MPO的活性，显著改善由5%葡聚糖硫酸钠诱导的大鼠结肠炎。Chen等［6］研究发现 DHA 可通过抑制 NF-κB 和 TGF-β/Smad信号通路，减轻胆汁淤积性肝损伤。Tiesset等［16］研究发现DHA可通过调节炎症反应和抗炎反应，从而对铜绿假单胞菌所致的肺部感染发挥保护作用。上述多个体内体、外实验研究表明DHA对实验动物的多个器官炎症反应及功能障碍起抑制作用，提示DHA对上述疾病具有一定的治疗作用。本实验显示了相同的结果。DHA通过抑制促炎性细胞因子IL-1β、IL-6的分泌，同时促进保护性细胞因子IL-10的分泌，使促炎反应与抗炎反应达到再平衡，进而对急性肺损伤发挥保护作用。提示DHA可抑制急性肺损伤小鼠促炎性细胞因子的分泌，促进抗炎性细胞因子的分泌，促进促炎反应与抗炎反应的平衡，从而对急性肺损伤发挥保护作用。

本研究证明了DHA可促进抗炎性细胞因子IL－10的分泌，抑制促炎性细胞因子IL-1β、IL-6的产生，减少炎症细胞的浸润，改善肺组织病理变化，促进炎症反应与抗炎反应的再平衡，从而从多个方面对急性肺损伤的发生、发展起抑制作用。上述研究结果提示，DHA具有治疗急性肺损伤的潜在价值，并为其治疗提供新的理论依据。

图3 DHA对急性肺损伤小鼠BALF中细胞因子浓度的影响Figure 3 Effect of DHA on concentrations of cytokines in BALF of LPS-induced acute lung injury mice

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