非小细胞肺癌中EPHB6基因突变的筛选和功能预测

于 军，铁 茹，赵 鸽，张学策，陈宝莹

(1西安医学院第二附属医院中心实验室，西安 710038;2第四军医大学基础医学教学实验中心;3西安交通大学医学院第一附属医院麻醉科;4第四军医大学唐都医院放射科;*通讯作者，E-mail:chenby128@163.com)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理类型［1］，而远端转移是NSCLC患者的主要死亡原因。受体型酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)在NSCLC 的转移过程中发挥重要的作用［2］。EPH是RTKs中最大的一个亚家族，分为EPHA受体1-10(EPHA1-A10)和EPHB受体1-6(EPHB1-B6)。EPHB6受体与其配体Ephrin相互作用。当与其配体Ephrin相互作用后，EPH受体调控一系列的细胞生物学行为，包括细胞与细胞的相互作用、细胞迁移等，EPHB6缺失与晚期的NSCLC和癌症的进展密切相关［3，4］。DNA 分子中发生碱基的替换、增添和缺失而引起的基因结构的改变，即基因突变。肿瘤的发生是一个从突变的积累到选择进化，再到克隆起源的过程。虽然了解克隆的选择过程比较困难，但分析基因突变和肿瘤发生的关联将非常有助于研究细胞恶变的分子机制。借助于技术上的进步，近年来，科学家试图通过高通量基因测序的方法，筛查与肿瘤发生和发展相关的基因突变。鉴于其重要的生物学功能，EPHB6成为此类研究中重要的筛查基因之一。本研究通过测序筛查EPHB6编码区的序列，并通过生物信息学分析，结合体内外实验评价其功能性作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原发的肿瘤标本和癌旁的正常组织手术取自80例NSCLC患者(标本来自2000-2013年第四军医大学第二附属医院胸外科手术)，组织采用液氮速冻，并保存于液氮之中。对于肿瘤标本行组织学鉴定，只有活检显示肿瘤细胞多于70%的组织才用于后续分析。癌旁正常组织也采用组织学检测鉴定。所有患者都签署知情同意书，本研究得到西安医学院医学伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 EPHB6基因测序 采用DNAzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)抽提基因组 DNA。用 Primer 3软件设计引物，用于PCR扩增400-800 bp的片段，涵盖EPHB6完整的编码区［5］。双侧的DNA链采用PCR引物测序。测序BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，在 ABI3730xl自动DNA测序仪上完成。测序得到的EPHB6编码区序列与参考序列(GenBank accession No.NM_004445)进行比对。

1.2.2 生物信息学分析 生物信息学预测同时采用两种预测工具，分别是SIFT(Sort Intolerant from Tolerant，http://sift.bii.a-star.edu.sg/)和 Poly-Phen-2(Polymorphism Phenotype，http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)。操作按照预测系统的说明进行。SIFT的预测得分小于0.05，认为是有害突变;PolyPhen-2将突变分为有害、可能有害和无害3类。

2 结果

2.1 NSCLC中频发EPHB6突变

本研究通过对EPHB6整个编码区的测序，发现80例NSCLC患者中有3例(3.8%)存在EPHB6的有义突变(R52C，Q498H，915-917del各 1例)，而在3种NSCLC的细胞系A549、HTB56和HTB58中均未检测到EPHB6的突变。EPHB6编码区的结构图见图1(见第667页)，R52C和Q498H分别位于Ephrin配体结合结构域和FN3结构域。而缺失突变915-917del，位于EPHB6的酪氨酸激酶催化结构域(Tyrkc)和sterile alpha基序(SAM)之间。与结直肠癌中报道的点突变(D915G和G914V)相毗邻［6，7］。提示，该区域可能对于EPHB6的功能具有重要的意义。

2.2 突变可能造成EPHB6功能受损

目前已知的所有的EPHB6的体突变位点，共计26个。从组织病理学分类来看，3个突变位点发现于神经胶质瘤，5个位点发现于结直肠癌，9个位点发现于肺癌(其中R52C、Q498H和915_917del是我们首次筛查得到的)，2个位点发现于卵巢癌，6个位点发现于黑色素瘤，1个位点发现于胃癌。可见，肺癌中频发EPHB6突变。从结构域分布上来看，9个突变位点位于TyrKc激酶催化结构域，8个突变位点位于Ephrin配体结合结构域，2个位于FN3结构域，7个位于相邻结构域的连接处。可见，EPHB6编码区的各个部位都可能发生突变。由于EPHB6基因的高度保守性，提示EPHB6突变在肿瘤发生、发展中可能具有重要的功能性作用。

SIFT与Polyphen是比较权威的基因突变预测分析系统，研究者可以通过在线的方式对已知的突变位点进行功能预测。SIFT将分值小于0.05的突变界定为有害突变，Polyphen-2将突变分为三类:“probably damaging”、“possibly damaging”和“benign。SIFT与 Polyphen对于目前所有已知的EPHB6体突变预测的结果见表1。其中，SIFT预测有害突变11个，Polyphen-2预测有害突变15个，SIFT和Polyphen-2同时预测有害的突变8个，分别为:A685T(神经胶质瘤)、D345N(结直肠癌)、A203D(肺癌)、R52C(肺癌)、P728H(肺癌)、P728S(卵巢癌)、L21F(卵巢癌)、R704W(黑色素瘤)。

3 讨论

本研究中我们首次在NSCLC中鉴定得到EPHB6的新的体突变位点R52C、Q498H和915-917del，证明NSCLC中频发EPHB6突变。通过生物信息学分析的方法，预测了目前已知的EPHB6突变的功能，为下一步的功能学实验奠定了基础。

EPH作为受体型酪氨酸蛋白激酶中最大的一个亚家族，其突变在肿瘤当中的发生比较频繁。一项大样本的测序研究发现肺腺癌中有10种EPH基因发生了突变［8］。由于EPH相关细胞信号网络的复杂性，对于EPH突变的功能性作用及其后果还知之甚少［9］。EPHB6 的体突变位点在肺癌［8］、结直肠癌［6，7］、卵巢癌［10］和神经胶质瘤［7］中以往都有报道，但突变的功能不明。

本研究筛查了80例NSCLC患者和3例NSCLC细胞系，首次发现3个EPHB6的未报道过的突变位点。其中，缺失突变del915-917位于酪氨酸激酶结构域与SAM结构域之间。此区域最近在结直肠癌中也报道有体突变发生［6，7］。提示，此区域可能与肿瘤密切相关。

表1 发现于肿瘤组织的EPHB6(NM_004445和NP_004436)的所有有义体突变Table 1 All somatic mutations of EPHB6(NM_004445和NP_004436)found in tumor tissues

本研究采用的SIFT与Polyphen是比较权威的基因突变预测分析系统，研究者可以通过在线的方式对已知的突变位点进行功能预测。但是，这两个系统仅能预测点突变位点，对于缺失突变，例如本研究筛查到的915_917del不能预测。鉴于目前已知的大多数EPHB6突变均为点突变，我们对这些突变位点分别采用SIFT与Polyphen-2进行了预测分析。本研究显示，肺癌当中可能的EPHB6有害突变较多，且包括本研究新筛查到的R52C。其确切的生物学效应还需要功能性实验的进一步证实。

推测EPHB6突变不但造成EPHB6原有的肿瘤转移抑制效应消失，更重要的是其突变体具有促发肿瘤转移的作用。其中一种可能的机制为突变体通过“dominant negative”的方式对野生型EPHB6产生抑制效应。另外，突变体还可能激活促转移的信号通路及其网络。但这需要进一步的实验验证。

在肿瘤当中，EPHB6既存在“质”变，又存在“量”变。我们以往报道EPHB6存在表观遗传学调控，即“量”变，EPHB6在NSCLC中具有甲基化沉默现象，即其启动子区高甲基化造成其表达水平降低，并且EPHB6的低表达与肿瘤的转移密切相关。本研究证实EPHB6突变促发NSCLC转移，则表明EPHB6存在遗传学调控，造成其“质”变，即产生结构和功能异常的蛋白。抓住“质”和“量”这两条线，将有利于阐明EPHB6与NSCLC转移的功能性联系，为NSCLC的转移寻找新的突破点。

总之，NSCLC中多发EPHB6突变，并且EPHB6突变会导致NSCLC细胞产生利于迁移的表型。这可能归因于突变导致的EPHB6原有抗转移功能的缺失，也可能是突变体具有新的促转移功能。其确切机制还有待于进一步研究。

［1］Siegel R，Ma J，Zou Z，etal.Cancer statistics，2014 ［J］.CA Cancer J Clin，2014，64:9-29.

［2］Liu SV，Subramaniam D，Cyriac GC，etal.Emerging protein kinase inhibitors for non-small cell lung cancer［J］.Expert Opin Emerg Drugs，2014，19:51-65.

［3］Giaginis C，Tsoukalas N，Bournakis E，etal.Ephrin(Eph)receptor A1，A4，A5 and A7 expression in human non-small cell lung carcinoma:associations with clinicopathological parameters，tumor proliferative capacity and patients＇survival［J］.BMCClin Pathol，2014 ，14(1):8.

［4］Boyd AW，Bartlett PF，Lackmann M.Therapeutic targeting of EPH receptors and their ligands［J］.Nat Rev Drug Discov，2014，13:39-62.

［5］Ralser M，Querfurth R，Warnatz HJ，etal.An efficient and economic enhancer mix for PCR ［J］.Biochem Biophys Res，2006，347:747-751.

［6］Gylfe AE，SirkiäJ，Ahlsten M，etal.Somatic mutations and germline sequence variants in patients with familial colorectal cancer［J］.Int JCancer，2010，127:2974-2980.

［7］Balakrishnan A，Bleeker FE，Lamba S，etal.Novel somatic and germline mutations in cancer candidate genes in glioblastoma，melanoma，and pancreatic carcinoma［J］.Cancer Res，2007，67:3545-3550.

［8］Ding L，Getz G，Wheeler DA，etal.Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma［J］.Nature，2008，455:1069-1075.

［9］Pasquale EB.Eph receptors and ephrins in cancer:bidirectional signaling and beyond ［J］.Nat Rev Cancer，2010，10:165-180.

［10］Greenman C，Stephens P，Smith R，etal.Patterns of somatic mutation in human cancer genomes［J］.Nature，2007，446:153-158.