氟对大鼠肝组织中caspase-3和caspase-9基因表达的影响

刘茂林，樊林花，卫兵艳

(山西医科大学实验动物中心，太原 030001)

氟广泛存在于地球上，是机体必需的微量元素之一，适量的氟有利于维持机体钙磷代谢和保持神经兴奋的传导。但过多摄入可导致肝肾等多种组织器官的广泛损伤［1，2］。前期实验表明，过量氟化物导致大鼠肝细胞 DNA损伤，并可诱导细胞凋亡［3］，本研究观察氟化物对 肝 组织 caspase-3、caspase-9基因表达水平，明确氟化物导致大鼠肝细胞DNA损伤并诱导细胞凋亡是否与caspase-3、caspase-9基因表达水平有关，进一步了解氟化物对肝组织损伤机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

RNAiso Plus总RNA提取试剂(TaKaRa公司)、5×PrimeScript®RT Master Mix试剂盒(大连宝生物工程有限公司)、反转录SYBRPremix®Ex TaqTMII试剂盒9(大连宝生物工程有限公司)、DNA Marker(大连宝生物工程有限公司)、琼脂粉(西班牙)、高速冷冻离心机3-18K(美国 Sigma公司)、PTC-200PCR仪(美国Bio-Rad公司)、ABI 7300全自动荧光定量PCR(美国ABI公司)、可调微量移液器(德国eppendorf公司)。

1.2 动物分组、肝系数测定及标本的采集

清洁级雄性SD大鼠48只，体重(100±10)g，由山西医科大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(晋)2009-0001。将SD大鼠观察1周适应环境后，随机分为4组，每组12只，各组均饲喂大鼠正常饲料，对照组、低氟组、中氟组和高氟组分别自由饮用含0，50，100，200mg/L氟化钠去离子水。动物饲养于山西医科大学实验动物中心屏障环境［SYXK(晋)2009-0001］，每月测定实验动物体重，观察体重变化，染毒120 d。染毒结束，称量最后一次体重，麻醉后经右心灌注生理盐水，冲洗肝内血液，快速对大鼠的肝组织进行取材，用滤纸吸干表面血液，称重，测定肝系数［肝系数=肝质量(g)/体质量(g)×100%］。将肝组织迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，以备实时荧光定量PCR检测。

1.3 肝组织中 caspase-3、caspase-9基因表达的实时荧光定量PCR检测

称取低温冻结的肝组织100 mg加液氮研磨成粉末状，按 RNAiso Plus试剂说明操作，提取总RNA，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳进行肝组织总RNA质量鉴定，核酸分析仪测量其浓度，用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。以β-actin作为内参照，caspase-3上游引物:5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’，下游引物:5’-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3’，产物长度147 bp;caspase-9上游引物:5’-CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA-3’，下游引物:5’-GACACCATCCAAGGTCTCGATGTA-3’，产物长度176 bp;β-actin上游引物:5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’，下游引物:5’-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3’，产物长度115 bp。然后进行扩增:95 ℃ 30 s;然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，添加溶解曲线，反应结束后，电脑自动输出溶解曲线及对应Q值(达到阈值循环数)和扩增曲线。取6μl PCR产物经2%琼脂糖进行凝胶电泳，采用凝胶成像系统观察，以进行PCR产物鉴定。

1.4 实验数据处理及分析

相对表达量比较采用2-ΔΔCt法分析，表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。ΔCt(染氟组)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);ΔCt(对照组)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);ΔΔCt=ΔCt(染氟组)-ΔCt(对照组)。目的基因的相对表达水平=2-ΔΔCt。

样品的阈值线设置相同，采用SPSS13.0统计软件计算重复样品间Ct均值及标准偏差，应用2-ΔΔCt法处理数据。

1.5 统计学分析

实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析及LSD-t法检验。

2 结果

2.1 不同染氟时期大鼠的体重变化

从表1可知，染氟过程中各组大鼠生长发育良好，体重均明显增加。经统计分析，不同时期各染氟组体重与相应的对照组相比，差异无统计学意义，各染氟组之间体重两两比较差异也无统计学意义。

2.2 氟对各组大鼠肝脏脏器系数的影响

从表2可知，染氟组大鼠肝脏脏器系数与对照组相比，差异无统计学意义;各染氟组间比较差异也无统计学意义。

表1 不同染氟时期大鼠的体重变化(±s，g)Table 1 Changes of body weight of rats exposure to different concentrations of fluoride for different time(±s，g)

表1 不同染氟时期大鼠的体重变化(±s，g)Table 1 Changes of body weight of rats exposure to different concentrations of fluoride for different time(±s，g)

各染氟组与对照组比较，P＞0.05

中剂量组 12 104.0±9.9 204.4±25.8 294.4±27.5 340.8±53.7 453.7±37.6高剂量组 12 105.6±9.1 209.9±19.4 283.6±40.5 366.3±23.7 400.2±35.5

表2 各组染氟120 d大鼠肝脏脏器系数Table 2 Comparison of liver coefficient after exposure to different concentrations of fluoride for 120 d

2.3 肝脏组织总RNA的浓度和纯度

大鼠肝脏RNA经提取纯化后，在1.0%琼脂糖凝胶电泳进行快速分析(15 V/cm)，从图可以看出，总RNA有明显三条带(5S，18S和28S)，表明总RNA的完整性较好，基本无降解。SD大鼠肝组织总 RNA，吸光度 A260/A280均在 1.8-2.0 之间，表明总RNA的纯度达到了实验要求(见图1)。

图1 总RNA电泳图Figure 1 Total RNA electrophoresis of rat liver tissues after exposure to different concentrations of fluoride

2.4 样品扩增动力学曲线和溶解曲线分析

实验组与对照组SYBR GreenⅠ荧光定量PCR溶解曲线所得的caspase-3、caspase-9扩增时的Tm值非常均匀，并且峰值单一(见图2)，说明没有引物二聚体和非特异性条带形成。由扩增曲线看出扩增曲线间距非常均一，平行性较好(见图2)，说明目的基因与内参基因扩增效率一致，符合在不制作标准曲线的情况下进行相对定量的条件。

2.5 目的基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶水平电泳检测

目的基因 PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳得caspase-3、caspase-9、β-actin 片段分别为 147 bp、176 bp、115 bp，确定为所需要的目的基因(见图3)。

2.6 氟对大鼠肝脏caspase-3基因和caspase-9基因表达的影响

相对定量分析表明，氟诱导大鼠肝脏细胞损伤，引起了caspase-3和caspase-9基因表达水平的改变(见表3)，低、中、高剂量组caspase-3基因表达量分别是对照组的0.34±0.10、1.37±0.43 和2.27±0.73倍，其中高氟组表达显著增高(P＜0.05);caspase-9的基因表达量分别是对照组的1.03±0.36、3.05±0.68 和 5.85±0.52倍，中氟组和高氟组表达显著高于对照组(P＜0.05)。

3 讨论

caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，其家族成员大部分是凋亡的启动子或效应子，在细胞凋亡过程中发挥着重要作用［4］。目前研究者发现的有15种caspase，根据caspase在级联反应的上、下游所处位置和其功能的不同，把它分为三大类，第一类为凋亡始动子，它位于级联反应的上游，它们是包括caspase-2、caspase-8、caspase-9 等，能在其他蛋白参与下发生自我活化并激活下游的caspase。第二类是凋亡效应子，它位于级联反应的下游，分别是caspase-3、caspase-6、caspase-7，它们能被上游的始动子激活，而激活后的caspase作用于那些特异性底物上，使细胞发生形态学及生化等改变，最终导致细胞凋亡等其他改变。第三类包括caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-13、caspase-14，此类 caspase 在细胞因子介导炎症反应中发挥着主要作用，其次还在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起到辅助作用［5］。

图2 β-actin、caspase-3、caspase-9荧光定量PCR扩增曲线(左)和溶解曲线(右)Fig 2 Amplification curve(left)and dissolution curve(right)of fluorescence quantitative PCR for the β-actin，caspase-3 and caspase-9

图3 RT-PCR产物检测Figure 3 RT-PCR product of caspase-3 and caspase-9

有研究表明，caspase酶原可以通过以下几种方式激活:自活化(autoactivation)、转活化(transactivation)和非caspase蛋白酶活化(activation by noncaspase proteinases);caspase酶原在某种条件下有自活化的潜能，比如这种酶原在高浓度时可以自活化［5］，把 caspase-2的原域和 caspase-3酶原融合起来，大大增强了酶原的自活化和caspase-3诱导的凋亡［6，7］。caspase-9 能激活酶原 caspase-3 和 caspase-7，但不能激活caspase-6，caspase-3反过来可以再激活 caspase-9 及 caspase-8，这样形成正反馈［8］，即活化的 caspase-9 激活 caspase-3［9］和 caspase-7，活化的caspase-3反过来又能激活caspase-9酶原，形成正反馈通路。

本实验采用实时荧光定量PCR技术对肝组织caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达进行检测发现，氟诱导大鼠肝脏细胞凋亡以及对肝细胞DNA损伤的同时，引起了caspase-3和caspase-9 mRNA表达水平的增高，低剂量的氟对caspase-3 mRNA表达量较caspase-9 mRNA影响不显著，中、高剂量的氟对caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达影响均很明显，呈上升趋势，特别是中、高剂量组的caspase-9 mRNA表达量分别是对照组的3.05±0.68、5.85±0.52倍。通过检测大鼠体重及肝脏脏器系数，染氟组与对照组相比，体重及肝脏脏器系数差异均无统计学意义，说明氟对体重及脏器系数无明显影响，可能是因为大鼠首次接触外来物质需要一个适应过程，氟在该过程中对机体体重及脏器系数的影响可能未显示出来。

综上所述，氟引起的 caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达较对照组增高，高剂量组caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达较中剂量组增高，中、高剂量的氟对 caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达影响更大。根据以上实验结果可以发现，低剂量氟进入大鼠肝组织内后，并不一定能立刻激活caspase-9，随着氟剂量的增大和染氟时间的延长，氟有可能引起一系列肝组织细胞因子的改变，激活caspase-9，进而激活caspase-3最终导致肝组织细胞的损伤。由此推测氟对肝细胞DNA损伤以及诱导细胞的凋亡，可能是通过激活caspase-3和caspase-9而促进了细胞DNA损伤和凋亡的发生，当然，氟对大鼠肝组织的损伤作用及机制复杂，还有待更进一步探索。

表3 不同染氟剂量大鼠肝组织caspase-3和caspase-9基因表达变化Table 3 Expression levels of caspase-3 and caspase-9 mRNA in liver tissue of rats exposed to different concentrations of fluoride

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