不同时间窗中药对血管性痴呆小鼠脑神经递质的影响*

河北工业大学医院 孙丽芳 张丽欣 高 红 (天津300130)

随着人们生活水平的提高，脑血管病成为了严重影响人们健康和生命安全的疾病之一。近年来，医疗水平亦不断提高，虽然脑血管疾病病死率有所下降，但脑血管病造成的各种功能和智力障碍却得不到有效治疗。血管性痴呆(VD)是由多种因素导致脑组织受到损伤后引起的痴呆综合征的总称。［1］临床实践中发现，中医药在治疗VD 方面有较显著疗效，但治疗本病的最佳时机却不明确。［2］本研究通过复制血管性痴呆小鼠模型，观察不同时间窗中药益气活血方治疗血管性痴呆的疗效，为临床选择合适时机治疗该病提供可靠的实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 雄性昆明小鼠50 只，体质量29 g±2.5 g (由河北医科大学实验动物学部提供)。

1.2 益气活血方的药物组成 黄芪120 g，赤芍、当归各9 g，地龙、桃仁、红花、川芎各6 g(课题组自制成1 g 生药/mL)。本实验中所应用的中药均购自北京同仁堂药房，经过河北医科大学中医学院中药系的鉴定后均符合国家药典标准。

1.3 本实验主要试剂 去甲肾上腺素(NE)、5－羟色胺(5－TH)、多巴胺(DA)均由中国生物药品制品检验所提供。

1.4 本实验主要仪器 C－R2Ax 数据处理机、LC－4A 高效液相色谱仪均为日本岛津公司生产。

2 方法

2.1 模型复制 模型的制备参照文献，［3］将动物用10%水合氯醛(350 mg/kg，腹腔注射)麻醉，颈正中部常规消毒后切口，分离双侧颈总动脉，套“4”号丝线扣，拉紧丝扣，阻断血流20 min，同时在距尾尖1 cm 处剪断放血约0.3 mL，热凝止血。松开丝扣使血液灌注10 min 后，再次阻断血流20 min，第2 次再灌注后观察30 min，缝合皮肤。其中假手术组只分离颈总动脉，穿线不结扎，尾部不放血，观察时间与其他组相同。术后每日肌注青霉素0.2 万U，连续3 d。本实验维持动物肛温36℃±0.5℃，防止低温对缺血所致脑损伤的保护作用。

2.2 实验的分组及给药途径 将实验用昆明小鼠随机分为5 组，每组为10 只，均连续给药治疗10 天，每日给药1 次。(1)假手术组:予蒸馏水按10 mL/kg 体质量灌服;(2)模型组:予蒸馏水按10 mL/kg 体质量灌服;(3)益气活血方即刻治疗组:每日予36 g 生药/kg 体质量灌服(此剂量相当于成人服药剂量的15 倍)，造模后即刻给药。(4)益气活血方3 天治疗组:相同剂量药物，造模3 天后给药。(5)益气活血方10 天治疗组:相同剂量药物，造模10 天后给药。

2.3 脑内神经递质测定 在治疗结束后，各组小鼠均快速断头取脑组织，在冰盘上分离出其大脑皮层，放于－80℃冰箱中。取部分组织做样品，以3 000 r/min、4℃离心10 min，将离心后的上清液，置于1.5 mL Ependorf 管中，提取NE、DA、5－TH时备用。标准品与样品的处理方法相同。

计算NE、DA 的公式为:

NE、DA 含有量=补正系数×面积×内部标准量×100/内部标准峰面积×试样量。

计算5－TH 的公式为:

5－TH 含有量=补正系数×面积×100/试用量，分析标准试样后求得补正系数。

2.4 统计学处理 实验中的所有数据用SPSS13.0 for windos 统计软件进行统计，用成组设计的方差分析，数据采用±s 表示。以0.05、0.01 为差异有显著性水平的标准。

3 结果

益气活血方对各组VD 模型小鼠其大脑皮层中的各种神经递质影响:研究结果显示，大脑皮层组织中的神经递质模型组与假手术组相比明显降低(P＜0.01);经用益气活血方后，即刻治疗组、3天治疗组NE、DA、5－TH 含量均较模型组小鼠明显增高(P＜0.05)，10 天治疗组含量虽有增高，但差异无显著性(P＞0.05)，其中，即刻治疗组脑组织中的NE、DA、5－TH 含量均较3 天治疗组明显增高(P＜0.05)。详见表1。

表1 益气活血方对VD 模型小鼠大脑皮层中神经递质的影响 (±s)，ng/g 湿重

表1 益气活血方对VD 模型小鼠大脑皮层中神经递质的影响 (±s)，ng/g 湿重

注:与模型组比较，* P＜0.05、＊＊P＜0.01;与3 天治疗组比较，△＜0.05

组别 例数(只)NE DA 5－TH假手术组 10 285.34±57.63＊＊ 554.75±90.51＊＊ 703.40±110.31＊＊模型组 10 169.52±35.89 234.18±43.72 413.09±73.12即刻治疗组 10 249.47±40.42＊＊△ 504.83±85.49＊＊△ 653.71±88.45＊＊△3 天治疗组 10 205.72±37.13* 423.47±81.32* 534.77±85.10*10 天治疗组10 198.35±36.41 277.08±52.47 483.12±81.39

4 讨论

中医对VD 的研究由来已久，《景岳全书》中第一次提出痴呆的病名、病因与临床表现，古代医学家认为本病系年迈体衰，正气亏虚，运行不畅，气虚血瘀等导致，并认为其主要病机［4］为中风导致气血瘀滞，清窍失灵，渐至痴呆。病位在脑，病性多为本虚标实，精血亏虚为本，痰瘀互结、蒙蔽清窍为标。益气活血方药物组成应用补阳还五汤原方。该方为益气活血通络的经典方，由黄芪、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙组成。方中黄芪重用为君，大补元气，意在气旺以促血行，祛瘀而不伤正;配以当归尾为臣，有活血祛瘀而不伤正气之妙;桃仁、红花、川芎、赤芍助当归尾活血祛瘀，其中川芎具升浮之性，善上行头巅，为治脑部瘀血证之良药，地龙通经活络，共为佐使。［5］诸药合用，使气旺血型、祛瘀络通，脑髓得养，灵机记性渐归于常。

现代研究表明，引起血管性痴呆的因素主要为脑缺血，［6］而脑缺血又可以造成神经递质的代谢异常。脑缺血早期，由于ATP 尚未消耗完毕，所以神经递质的合成与释放受到的影响均较小，减少不明显，然而神经递质的分解过程耗能相对更大，故而受到影响较大，造成其合成释放较分解增加，所以突触间隙神经递质的含量会较前有所升高。大脑缺血的时间越长，胺泵以及膜泵受到抑制越大，造成突触前膜再次摄取神经递质会明显减少甚至停止。在这时，钠泵转运受到阻碍又会造成一部分细胞变得水肿，进而破裂。递质外溢后，细胞外液递质仍会较前增高;脑缺血的后期，递质合成受到影响，递质合成不足，故储存在囊泡中的神经递质也会相应的减少，神经元会更加受损，以致于部分神经元坏死，也就丧失了合成、释放神经递质的能力。［7］本实验中血管性痴呆的模型就是反复缺血再灌注引起，而时间窗的概念正是缘于治疗缺血性卒中。

研究表明，“缺血半暗带”的提出，为缺血性卒中的治疗提供了理论基础。［8］缺血半暗带是坏死灶的中心与正常组织间的交接区，该区域虽然细胞结构存在但细胞功能受到损害，这一部分缺血的脑组织因缺血影响细胞的电生理活动，造成电生理活动的停止，但是仍然可以维持跨膜离子的平衡。距离脑缺血中心较近的脑组织发展为不可逆性脑损伤时间较为缓慢，甚至可能延迟到数小时。缺血半暗带从可逆性的缺血向不可逆性损伤的进展由多种病理机制参与，随着缺血时间的延长，最终导致治疗效果降低。研究提示，缺血半暗带的面积、大小受很多因素的影响，例如:侧支循环的建立、患者血压、当时的体温以及缺血组织对缺血的耐受性等。［9］因此，因缺血导致卒中的治疗时间窗有一定的个体差异。由此可见，因脑缺血再灌注导致的血管性痴呆，在治疗中也存在时间窗的概念。

本研究还显示，VD 小鼠大脑皮层组织中NE、DA、5－TH 的含量模型组与假手术组比较明显降低(P＜0.01)，说明了单胺类神经递质代谢紊乱参与了脑缺血损害病理过程。益气活血方即刻治疗组、3 天治疗组中NE、DA、5－TH 的含量均较模型组有显著提高(P＜0.05)，其中，即刻治疗组中脑组织中的NE、DA、5－TH 含量均较3 天治疗组明显增高(P＜0.05)。提示较早期治疗效果显著，其机理之一可能为通过改善单胺类神经递质的代谢，使皮层内神经递质的含量增加，进而缺血半暗带发生了可逆性变化。10 天治疗组含量虽有增高，但差异无显著性(P＞0.05)，表明随着时间推移，半暗带从潜在的可能性缺血逐渐向不可逆性损伤的进展。

［1］WooJ I，LeeJH，Yoo KY，et al．Prevalence estimation of dementioa in a rural area of Korea ［J］.American Geriatries Society，1988，46:983－987

［2］陈磐华，吴永杰，秦俊法.加味补阳还五汤治疗血管性痴呆临床研究［J］.中国中医药信息杂志，2007，14 (7):25－26

［3］张会珍，张丽欣，余延芬，等.电针对拟血管性痴呆小鼠脑组织海马细胞凋亡的影响［J］.针刺研究，2008，33 (6):377－381

［4］张泓波，高维娟，钱涛，等.补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马CAMP－PKA－CREB 信号通路的影响［J］.中国病理生理杂志，2011，27 (4):718－721

［5］孙丽芳，张丽欣，王志刚.补阳还五汤加减治疗血管性痴呆32 例［J］.河北中医药学报，2013，28 (3):11－12

［6］胡云南.丁基苯酞治疗血管性痴呆的临床疗效观察［J］.中风与神经疾病杂志，2010，27 (1):26－27

［7］张凯，魏民，郝宪恩，等.益气活血复方对急性脑缺氧小鼠神经递质的影响［J］.中药药理与临床，2005，21 (1):46－48

［8］Hakim AM.Ischemic pneumbra:the therapeutic window［J］.Neurology，1998，51 (3Suppl3):44－46

［9］Scheller D，KolbJ，SzathmaryS，et al.Extracellular changes of Glutamate in the periinfarctzone:effect of lubeluzole［J］.JCereb Blood Flow Metab，1995，15 (Suppl1):379－381