针刺联合紫杉醇对肺癌小鼠P－GP、CYP2C8蛋白表达的影响*

辽宁中医药大学针灸推拿学院

陈佳丽 成泽东 李春日 张志星 张小卿 陈以国 (沈阳110032)

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。目前，安全、有效的“针药并举”综合疗法成为抗肺癌治疗的重要手段之一，以往的研究已经证实针刺特定穴位能增加相应器官药物“靶向”作用，［1－4］但缺乏对其内在机理的研究，因此，本实验通过分析针刺对紫杉醇药物代谢相关蛋白P－GP、CYP2C8 活性的影响，试图阐明针刺协同增效的主要机制，开辟针药结合研究药代动力学及其机理的新方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 千分电子天枰［赛多利斯科学仪器(北京)有限公司］，移液枪(北京吉尔森科技有限公司)，高速匀浆机(IKA T10 basic)，TCL－16 高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，WH－2 微型漩涡混合仪(上海泸西分析仪器厂有限公司);elisa 试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)，生理盐水，紫杉醇注射液(哈药集团生物工程有限公司，国药准字H2005996)。

1.2 实验动物与分组 选择7 周龄，雌性BALB/C 系小鼠72 只，小鼠由上海思莱克实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK (沪)2007－0005，动物合格证号:2007000535185。将小鼠随机分为4 组，每组18 只，即模型对照组 (第1组):腹腔注射紫杉醇同体积生理盐水;针刺肺俞组(第2 组):腹腔注射紫杉醇同体积生理盐水，针刺“肺俞”穴;紫杉醇药物组(第3 组):腹腔注射紫杉醇;针刺肺俞+紫杉醇药物组(第4 组):腹腔注射紫杉醇，针刺“肺俞”穴。

1.3 动物模型的建立 采用NTCU (N－nitroso－tris－chloroethylurea)诱发小鼠肺鳞状细胞癌造模法。［5］具体方法:室温控制在21℃±2℃，空气定期用紫外线消毒，垫料高压灭菌。动物自由饮水和摄食，饮冷开水，用每日新鲜蒸热的标准混合饲料。小鼠背部刮毛，采用NTCU (溶解于丙酮)涂抹小鼠背部皮肤，25 μL (0.04 M NTCU)，周两次，每周刮毛1 次，第8 个月造模结束。组织学检查确认造模成功。

1.4 处理因素

1.4.1 针刺治疗:时间，给药前针刺;方法，选用“华佗牌”38 号针灸针(0.18 mm×25 mm)，针刺第2 组、第4 组，顺经30°角斜刺，刺入皮下2 mm，接6805－A 型电针仪，施以疏密波，频率2 Hz，强度2～4 mA，留针15 min。每日1 次，连续5 次。模型对照组和紫杉醇药物组均与施加因素组同样捆绑在小鼠固定架上，以保持外界因素一致。以上穴位选取参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》取穴。

1.4.2 药物治疗:时间，最后1 次针刺后立即给药;根据人临床推荐用量及不同种属之间药物剂量的换算法，确定小鼠的给药剂量为紫杉醇6 mg/kg，将紫杉醇注射液用生理盐水稀释至0.6 mg/mL，腹腔注射给药。

1.5 取材与处理 肺脏、肝脏、肾脏组织elisa试剂盒样品:给药后1、2、8 h 每一时间点取6 只小鼠眼球取血处死，取样，用电子天枰分别称取各脏器100 mg 置于1 mL 的EP 管中，加入0.8 mL 生理盐水低温下高速匀浆，涡旋1 min，将匀浆液以5 000 r/min 高速离心5 min，提取上清液。

1.6 指标检测 检测小鼠不同组肺脏、肝脏、肾脏组织中P－GP、CYP2C8 的含量。具体检测过程严格按照elisa 试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 小鼠不同治疗组、不同时间点肺、肝、肾脏组织中的P－GP 含量的比较 肺、肝、肾脏器组织中相同治疗组不同时间点P－GP 含量的比较，差异无显著性(P＞0.05);相同时间点不同治疗组P－GP 含量的比较，药物组和针刺肺俞加药物组明显低于模型组(P＜0.01);针刺肺俞加药物组P－GP 含量与药物组相比差异有显著性(P＜0.05);而针刺肺俞组与模型组比较，差异无显著性(P＞0.05)。见图1、图2、图3。

图1 小鼠肺脏中1、2、8 h 各组中P－GP 含量的比较

图2 小鼠肝脏中1、2、8 h 各组中P－GP 含量的比较

图3 小鼠肾脏中1、2、8 h 各组中P－GP 含量的比较

2.2 小鼠不同治疗组、不同时间点肺、肝、肾脏组织中CYP2C8 含量的比较 小鼠各脏器相同治疗组1、2、8 hCYP2C8 的含量差异无显著性(P＞0.05);不同治疗组相同时间点组织中CYP2C8含量的比较，模型组组织中CYP2C8 的浓度最高，与药物组和针刺加药物组比较，差异有非常显著性(P＜0.01);针刺肺俞加药物组的CYP2C8 浓度最低，与药物组相比差异有显著性(P＜0.05);模型组与针刺肺俞组比较差异无显著性 (P＞0.05)。如图4、图5、图6。

图4 小鼠肺脏中1、2、8 h 各组中CYP2C8 含量的比较

图5 小鼠肝脏中1、2、8 h 各组中CYP2C8 含量的比较

图6 小鼠肾脏中1、2、8 h 各组中CYP2C8 含量的比较

3 讨论

3.1 P－GP 的表达与肺癌化疗药物紫杉醇的关系 P－GP 分布在许多组织(如血－脑屏障、肾、肝、肺、脾等)的上皮细胞，属于ABC 类载体，它能够与ATP 结合，并利用ATP 跨膜转运物质。P糖蛋白具有调节药物在组织中渗透和加快药物从组织消除的功能，［6］是影响药物体内过程最主要的转运子，紫杉醇主要受P 糖蛋白介导的外排作用，P糖蛋白的表达和组织分布决定紫杉醇的吸收、分布和清除。本实验结果显示:与模型组比较，单纯针刺组P－GP 含量变化不显著，说明单纯针刺可能与P－GP 的表达不相关;与模型组和单纯针刺组比较，药物组和针刺药物组各脏器中P－GP 的含量明显降低，且针刺药物组中的含量最低，提示紫杉醇药物使P－GP 的含量减少，且针刺抑制了PGP 的表达，减慢了紫杉醇的药物代谢，从而增加了肺癌的治疗作用。

3.2 CYP2C8 与肺癌化疗药物紫杉醇的关系CYP2C8 是一种重要的CYP 酶，是药物生物转化Ⅰ相反应的限速酶，它参与了很多临床治疗意义重大的药物的代谢过程，这些药物涉及到抗肿瘤药物、降糖药物、心血管药物等。其中以抗肿瘤药物—紫杉醇最为重要。紫杉醇主要受CYP2C8 的代谢，［7］转化为无活性的代谢产物而被清除。上述实验结果表明，针刺明显减少了经药物注射后小鼠各脏器中CYP2C8 的含量，抑制了紫杉醇的药物代谢，提高治疗效果。

本实验还观察到1、2、8 h 各组中P－GP 及CYP2C8 的含量变化不显著(P＞0.05)，提示时间可以不作为P－GP 及CYP2C8 含量检测的影响因素。

［1］成泽东，陈以国，张利泰.针刺对大鼠体内中药有效成分趋向性影响的实验研究［J］.中国针灸，2002，22 (1):51－53

［2］陈以国，成泽东，陈明明.针刺对紫杉醇在Lewis 肺癌小鼠体内分布趋向性影响的实验研究［J］.中华中医药学刊，2009，27 (8):1 584－1 587

［3］成泽东，陈以国.针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis 肺癌细胞凋亡相关因子p53、bcl－2 蛋白表达的影响［J］.中国中医药信息杂志，2007，14 (5):23－24

［4］成泽东，陈以国.针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis 肺癌细胞凋亡的影响［J］.针刺研究，2007，32 (6):135－157

［5］Wang Y.，Zhang Z.，Yan Y.，Lemon W.J.，LaRegina M.，Morrison C.，Lubet R.，You M.，A chemically induced model for squamous cell carcinoma of the lung in mice:histopathology and strain susceptibility［J］.Cancer Res，2004，64:1 647－1 654

［6］Srinivas E.，Murthy J.N.，Rao A.R.，Sastry G.N.，Recent advances in molecular modeling and medicinal chemistry aspects of phospho－glycoprotein ［J］.Curr Drug Metab，2006，7:205－217

［7］Gustafson D.L.，Long M.E.，Bradshaw E.L.，Merz A.L.，Kerzic P.J.，P450 induction alters paclitaxel pharmacokinetics and tissue distribution with multiple dosing ［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2005，56:248－254