注射用兰索拉唑细菌内毒素检查方法学研究

秦序锋??王开颖

[摘要] 目的 建立注射用兰索拉唑细菌内毒素的检查方法。 方法 采用凝胶法，按《中国药典》2010年版关于细菌内毒素检查法进行结果判断。 结果 注射用兰索拉唑与鲎试剂及细菌内毒素不存在干扰。 结论 凝胶法可以用来检测注射用兰索拉唑的细菌内毒素。

[关健词] 注射用兰索拉唑；细菌内毒素；凝胶法

[中图分类号] R927.1 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）21-24-03

注射用兰索拉唑（规格：30mg）为白色至类白色疏松块状物。主要用于口服疗法不适用的伴有出血的十二指肠溃疡。兰索拉唑属于质子泵抑制剂，本药分布于胃黏膜壁细胞的酸性环境后，转变为有活性的代谢物。这种代谢物与存在于酸生成部位的H+-K+-ATP酶的巯基结合，通过抑制H+-K+-ATP酶的活性而抑制酸分泌。

1 仪器与试药

1.1 药品

注射用兰索拉唑（浙江佐力药业股份股份有限公司，20130501、20130502、20130503，规格：30mg）。

1.2 试药

TAL（Ⅰ：福州新北生化工业有限公司， 12020913，灵敏度0.125 EU/支；Ⅱ：湛江安度斯生物有限公司，1205035，灵敏度0.125 EU/支）；BET检查用水（湛江安度斯生物有限公司，1212080，规格：5mL/支）；细菌内毒素工作标准品[1-2]（中国药品生物制品检验院，1206，120EU/支）。

1.3 仪器

GHP-9270型恒温器（上海一恒公司）；ZH-2型旋涡混合器（天津药典标准仪器厂）；BD-2CD型垂直净化工作台（杭州汇尔仪器设备有限公司）；HWC-300型数显恒温水浴箱（南京环科试验设备有限公司）。

2 方法与结果

2.1 限值计算[3-4]

根据注射用兰索拉唑临床使用说明书，本品临床使用剂量每小时为30mg，根据内毒素限值计算公式：L=K/M， 其中L为供试品内毒素限值，K为5EU/（kg·h），M为人体每公斤体重每小时最大用药量。中国人按照平均体重60kg计算，人体表面积按1.62m2，注射时间不足1h按1h计。根据公式计算限值结果为10EU/mg，为保证临床用药安全，我们将限值定为5EU/mg。

2.2 鲎试剂灵敏度复核[5]

取细菌内毒素工作标准品加WBET溶解后混合15min，按照下列稀释方法进行稀释。

即得0.03EU/mL的浓度，分别制成2λ，λ，0.5λ，0.25λ四个不同浓度的标准溶液，每一浓度平行做四管，每一步稀释均应在混合器上旋涡混匀

30s，同时做2支阴性对照管。加样后用封口膜封口，轻轻振动混匀，放入（37±1）℃的恒温器内，保温（60±2）min后观察结果。见表1。

判断方法：将试管返转180°。

阳性： 凝胶不变形，倒立凝胶不脱落阴性：无凝胶或凝胶不完全，倒立凝胶胶落。

结果显示，两批鲎试剂经复核，结果均符合0.5λ≤λc≥2λ，可用于细菌内毒素检查。

2.3 确定最大有效稀释倍数[1]

最大稀释倍数的公式MVD=CL/λ，C为供试品的浓度（取本品1支，加BET检查用水6mL，浓度为5mg/mL溶液），根据市售的鲎试剂灵敏度多在0.25～0.03EU/mL之间，因此注射用兰索拉唑的最大稀释倍数为MVD=（5mg/mL×5EU/mg）/0.03EU/mL=833倍，因此注射用兰索拉唑的MVD稀释倍数为50～800倍。

2.4 干扰预试验[6]

取批号20130501注射用兰索拉唑做干扰预试验。用细菌内毒素检查用水将注射用兰索拉唑供试品溶液进行逐级稀释，制得50倍、100倍、200倍、400倍、800倍系列稀释液，作为供试品阴性对照（NPC）。另配制与NPC相同浓度梯度的供试品溶液，每个浓度添加等体积细菌内毒素工作标准品，制得每个浓度均含2λ细菌内毒素的系列溶液，作为供试品阳性对照（PPC）。每个浓度平行做两管，同时作阳性对照（PC）、阴性对照（NC），同时取2个厂家灵敏度0.25EU/mL的鲎试剂进行试验。见表2

判断标准：当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照管2管为阳性时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释浓度即为最小不干扰稀释浓度。选择该稀释浓度进行干扰试验。由表2可知，注射用兰索拉唑稀释50倍以上可以消除对细菌内毒素的干扰。

2.5 干扰试验[7-10]

参照干扰预试验的试验结果，取2个不同生产厂家的鲎试剂（灵敏度0.125EU/mL），取注射用兰索拉唑，加BET检查用水稀释制成0.05mg/mL的溶液进行干扰试验。分别用供试品溶液和BET水将细菌内毒素工作标准品稀释成含2λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ系列浓度的溶液，同时平行做2管进行BET水及供试品的阴性对照，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。见表3。

判断标准：（1）阴性管为阴性；（2）供试品管为阴性；（3）0.5λ≤Es≥2λ。

由结果可知，采用供试品溶液（0.05mg/mL）进行干扰试验， Es结果均在范围之内，说明采用灵敏度为0.125EU的鲎试剂对细菌内毒素检查无干扰。

2.6 注射用兰索拉唑细菌内毒素检查[11]

取三批注射用兰索拉唑，采用0.25EU/mL鲎试剂灵敏度，依照中国药典2010版二部附录Ⅺ E法进行检查。见表4。

由实验结果可知，NC和NPC均为阴性；PPC和PC均为阳性，供试品均为阴性，3批样品的细菌内毒素均符合规定，说明该方法可用于注射用兰索拉唑细菌内毒素的检查。endprint

3 讨论

本试验在10万级背景下进行。洁净区及物体表面擦拭消毒，空调净化系统能正常启动并保持良好运行，尘埃粒子和沉降菌检测结果符合洁净级别要求[12]。

实验过程中使用的玻璃器血，洗净后应密闭于金属容器中，放置于250℃电热干燥箱中，干燥时间不少于0.5h，以保证除去内毒素。工作帽、手套、口罩要预先消毒灭菌。样品加样结束后，应轻轻振动混匀，避免产生气泡，并放入（37±1）℃的恒温器中，保温时间（60±2）min。

为了保证临床使用更加安全，我们将内毒素限值定为5EU/mg。细菌内毒素检查用水是指内毒素含量小于0.015EU且对细菌内毒素检查无干扰的灭菌注射用水。细菌内毒素检查法是通过鲎试剂与细菌内毒素在体外起凝胶反应的机制而完成的，因其所具有的特点和优点，目前已被各国药典所采纳，作为替代热原检查法的一种检测方法用于控制注射剂的质量。

[参考文献]

[1] 曹丽梅，肖丽华，刘明理.细菌内毒素国家标准品研制技术规范的介绍[J].中国药事，2013，27（11）：1201-1202.

[2] 于婷，蔡彤，张国来，等.细菌内毒素国家标准品原料的制备及其理化性质和生物学活性的分析[J].中国药学杂志，2010，45（5）：388-391.

[3] 戴艳，吉同琴，陈祥峰.注射用兰索拉唑细菌内毒素检查法[J].中国药师，2009，12（1）：122-123.

[4] 中国药典[S].2010版.（二部）.附录Ⅺ，E：99.

[5] 焉媛媛，章颖慧，周晓琳，等.血凝酶细菌内毒素检查法建立[J].中国药师，2014，17（3）：524-525.

[6] 蔡彤，张国来，李波，等.84种注射用药品细菌内毒素检查法的方法学研究[J].中国药学杂志，2010，45（2）；150-155.

[7] 贾瑞波，刘静，耿欣.注射用奈达铂细菌内毒素检查法的建立[J].中国药师，2014，17（2）：332-334.

[8] 王春玲，李孝壁，颜磊亭，等.注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素方法验证[J].中国医药科学，2014，4（1）：123-125.

[9] 褚奇星.参麦注射液细菌内毒素检查方法的探讨[J].中国医学创新，2014，11（8）：120-121.

[10] 吴丽敏，李玉基，魏霞，等.丁酸氯维地平细菌内毒素检查法质量标准研究[J].药学研究，2013，32（12）：702-704.

[11] 裴宇盛，蔡彤，张国来，等.中国药典2010年版细菌内毒素检查法仲裁方法研究[J].药物分析杂志，2013，33（9）：1628-1632.

[12] 马莉，张凇，王安航，等.细菌内毒素定量检测方法的常见问题剖析[J].中国医院药学杂志，2013，33（9）：733-734.

（收稿日期：2014-07-16）endprint

3 讨论

本试验在10万级背景下进行。洁净区及物体表面擦拭消毒，空调净化系统能正常启动并保持良好运行，尘埃粒子和沉降菌检测结果符合洁净级别要求[12]。

实验过程中使用的玻璃器血，洗净后应密闭于金属容器中，放置于250℃电热干燥箱中，干燥时间不少于0.5h，以保证除去内毒素。工作帽、手套、口罩要预先消毒灭菌。样品加样结束后，应轻轻振动混匀，避免产生气泡，并放入（37±1）℃的恒温器中，保温时间（60±2）min。

为了保证临床使用更加安全，我们将内毒素限值定为5EU/mg。细菌内毒素检查用水是指内毒素含量小于0.015EU且对细菌内毒素检查无干扰的灭菌注射用水。细菌内毒素检查法是通过鲎试剂与细菌内毒素在体外起凝胶反应的机制而完成的，因其所具有的特点和优点，目前已被各国药典所采纳，作为替代热原检查法的一种检测方法用于控制注射剂的质量。

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[8] 王春玲，李孝壁，颜磊亭，等.注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素方法验证[J].中国医药科学，2014，4（1）：123-125.

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[11] 裴宇盛，蔡彤，张国来，等.中国药典2010年版细菌内毒素检查法仲裁方法研究[J].药物分析杂志，2013，33（9）：1628-1632.

[12] 马莉，张凇，王安航，等.细菌内毒素定量检测方法的常见问题剖析[J].中国医院药学杂志，2013，33（9）：733-734.

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3 讨论

本试验在10万级背景下进行。洁净区及物体表面擦拭消毒，空调净化系统能正常启动并保持良好运行，尘埃粒子和沉降菌检测结果符合洁净级别要求[12]。

实验过程中使用的玻璃器血，洗净后应密闭于金属容器中，放置于250℃电热干燥箱中，干燥时间不少于0.5h，以保证除去内毒素。工作帽、手套、口罩要预先消毒灭菌。样品加样结束后，应轻轻振动混匀，避免产生气泡，并放入（37±1）℃的恒温器中，保温时间（60±2）min。

为了保证临床使用更加安全，我们将内毒素限值定为5EU/mg。细菌内毒素检查用水是指内毒素含量小于0.015EU且对细菌内毒素检查无干扰的灭菌注射用水。细菌内毒素检查法是通过鲎试剂与细菌内毒素在体外起凝胶反应的机制而完成的，因其所具有的特点和优点，目前已被各国药典所采纳，作为替代热原检查法的一种检测方法用于控制注射剂的质量。

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[6] 蔡彤，张国来，李波，等.84种注射用药品细菌内毒素检查法的方法学研究[J].中国药学杂志，2010，45（2）；150-155.

[7] 贾瑞波，刘静，耿欣.注射用奈达铂细菌内毒素检查法的建立[J].中国药师，2014，17（2）：332-334.

[8] 王春玲，李孝壁，颜磊亭，等.注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素方法验证[J].中国医药科学，2014，4（1）：123-125.

[9] 褚奇星.参麦注射液细菌内毒素检查方法的探讨[J].中国医学创新，2014，11（8）：120-121.

[10] 吴丽敏，李玉基，魏霞，等.丁酸氯维地平细菌内毒素检查法质量标准研究[J].药学研究，2013，32（12）：702-704.

[11] 裴宇盛，蔡彤，张国来，等.中国药典2010年版细菌内毒素检查法仲裁方法研究[J].药物分析杂志，2013，33（9）：1628-1632.

[12] 马莉，张凇，王安航，等.细菌内毒素定量检测方法的常见问题剖析[J].中国医院药学杂志，2013，33（9）：733-734.

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