新疆地区帕金森病遗传易感性与COMT和CYP 1A1基因多态性相互关系的研究

宋秋霞， 张晓莺， 李燕云

PD是一种严重影响中老年人生活质量的神经系统变性疾病，多数学者认为其是遗传和环境因素共同作用所致的。机体解毒系统的遗传差异可影响个体对PD的易患性，即当机体存在与解毒系统酶体系有关的遗传缺陷时，该机体对外界毒素的敏感性增强，在诱发条件下易患PD［1］。选择性的黑质多巴胺能神经元变性导致多巴胺(Dopamine，DA)减少或代谢异常是PD的核心，人们一直怀疑内源性DA对神经元有毒性作用，参与了PD的病理生理过程，而COMT正是催化DA降解的主要代谢酶［2，3］。PD的发生也可能与机体内参与易患环境毒素代谢酶的变异相关。CYP1A1是体内重要的一项代谢酶，在各种内外源性神经毒素体内代谢解毒过程中起重要作用。

目前，以上两个基因的部分位点多态性已被证实可能与散发性 PD 的发生相关［4～9］，且研究［10～12］发现二者均可通过与其它易患基因或者多态位点的相互作用导致PD患病风险增加。本研究中，我们选择主要参与机体内、外源性毒素代谢的COMT基因和CYP1A1基因为新疆地区PD患者的遗传学标记，分析其基因多态性在新疆地区同一研究对象中的分布特点，以探索两者的独立、联合作用与PD遗传易感性的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 (1)PD组:2008年1月 ～2011年4月在新疆南、北疆收集的维吾尔族、汉族散发性PD患者，共237例。包括维吾尔族92例(男57例，女35例)，年龄31～93岁，平均(65.30±10.23)岁;汉族145例(男89例，女56例)，年龄31～90岁，平均(68.60±10.16)岁;均符合英国 PD协会脑库诊断标准［13］。(2)对照组:来自同一时期新疆南、北疆收集的非脑部器质性疾病，无锥体外系疾病史、无神经系统变性病、精神疾患及家族史，在性别、年龄、民族及文化上与PD组匹配的健康维吾尔族、汉族，共247例，包括维吾尔族104例(男60例，女 44例)，年龄 33～99岁，平均(67.06±10.28)岁;汉族143例(男73例，女70例)，年龄 35～89岁，平均(66.84 ±11.15)岁。两组性别、年龄分布无统计学差异。该项研究的所有受检者均签署知情同意书。

1.2 DNA制备 取受检者外周静脉血2 ml，EDTA抗凝，-40℃保存。使用天根生化科技公司血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-80℃保存。

1.3 COMT基因G1947A多态性分析 用上游引物:5’-TCGTGGACGCCGTGATTCAGG-3’，下游引物:5’-AGGTCTGACAACGGGTCAGGC-3’进 行PCR。PCR体积25μl，条件:94℃ 5 min，再94℃30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共28 个循环后，72 ℃ 5 min终止反应。扩增片段长度217bp(2%琼脂糖凝胶电泳验证)。取PCR产物10μl加入10 U NIaⅢ内切酶及其缓冲液内，于37℃水浴中反应1 h后，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳并在紫外灯下分析结果，可见基因型:野生型G/G(81、136bp两个片段)，突变纯合型A/A(40、81、96bp 3个片段)，突变杂合型 G/A(40、81、96、136bp 4 个片段)。

1.4 CYP 1A1基因Msp I多态性分析 用上游引物:5’-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3’，下游引物:5’-TAGGAGTCTTGT CTCATGCCT-3’进行PCR。PCR体积25μl，条件:97℃ 7 min，再95℃50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，共30 个循环后，72 ℃10 min终止反应。扩增片段长度340bp(2%琼脂糖凝胶电泳验证)。取PCR产物7μl加入10 U Msp I内切酶及其缓冲液内，于37℃水浴中反应1 h后，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳并在紫外灯下分析结果，可见基因型:野生型T/T(340bp 1个片段)，突变纯合型C/C(200bp、140bp 2个片段)，杂合型T/C(340bp、200bp、140bp 3 个片段)。

1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理。按共显性等位基因特性计算各组等位基因和基因型频率。吻合度检验Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡定律。χ2检验分析各组基因多态性分布的差异。通过比值比(OR)的计算，对PD与各基因多态进行关联分析，用χ2检验计算OR与1之间差异的显著水平，计算病因分数(attributable fraction，AF)和人群病因分数(attributable fraction of population，AFP)或预防分数(preventive fraction，PF)和人群预防分数(preventive fraction of population，PFP)。显著性水平 a=0.05。

2 结果

2.1 COMT基因G1947A多态性的分布比较

吻合度检验表明:PD组和对照组COMT基因基因型观察值和期望值检测均符合H-W遗传平衡(PD组:P=0.893;对照组:P=0.90)。χ2检验结果示:在总体样本中、维吾尔族、汉族、男性、女性、年龄≥60岁的PD组与对照组间PD组与对照组间COMT基因基因型频率、等位基因频率分布的，差异均无统计学意义(均P＞0.05)(见表1)。

2.2 CYP 1A1基因Msp I多态性的分布比较

吻合度检验表明:PD组和对照组CYP 1A1基因基因型观察值与期望值检测均符合H-W平衡(PD组:P=0.988;对照组:P=0.211)。χ2检验结果示:在总体样本中、维吾尔族、汉族、男性、女性、年龄≥60岁的PD组与对照组间CYP 1A1基因基因型频率、等位基因频率分布的，差异均无统计学意义(均P ＞0.05)(见表2)。

2.3 COMT基因与CYP 1A1基因间的协同作用分析。

2.3.1 维吾尔族人群中，按 COMT基因 G/G基因型分组后，CYP 1A1基因多态性和PD的相关性分析χ2检验结果表明:在新疆维吾尔族人群中，携带COMT基因G/G基因型者，其CYP 1A1基因等位基因频率在PD组与对照组间的分布无统计学差异(P=0.123)，基因型频率分布有统计学差异(P=0.020)。相关分析显示:COMT G/G基因型和CYP 1A1 T/T基因型的协同作用与新疆维吾尔族人群中 PD的发生存在正关联(OR=3.288，AF=0.696，AF P=0.426)，即同时携带 COMT G/G 基因型和CYP 1A1 T/T基因型可使新疆维吾尔族个体发生PD的风险增加3.288倍，同时携带有COMT G/G基因型和CYP 1A1 T/T基因型的维吾尔族人群中有69.6% 患 PD，维吾尔族人群的 PD中有42.6% 同时携带有COMT G/G基因型和CYP 1A1 T/T基因型;而COMT G/G基因型和CYP 1A1 T/C基因型的协同作用与新疆维吾尔族人群中PD的发生存在负关联(OR=0.245，PF=0.755，PF P=0.472)，即同时携带COMT G/G基因型和CYP 1A1 T/C基因型可使新疆维吾尔族个体PD的发生风险降低0.245倍(见表3)。

2.3.2 年龄≥60岁人群中，按COMT基因G/G基因型分组后，CYP 1A1基因多态性和PD的相关性分析χ2检验结果表明:在新疆年龄≥60岁人群中，携带COMT基因G/G基因型者，其CYP 1A1基因等位基因频率在PD组与对照组间的分布无统计学差异(P=0.585)，基因型频率分布存在统计学差异(P=0.026)。相关分析显示:COMT G/G基因型和CYP 1A1 T/C基因型的协同作用与新疆地区年龄≥60岁人群中PD的发生存在负关联(OR=0.451，PF=0.549，PF P=0.350)，即同时携带 COMT G/G 基因型和CYP 1A1 T/C基因型可使新疆地区年龄≥60岁个体PD的发生风险降低0.451倍(见表4)。

表1 COMT基因G1947A多态性的分布比较结果

表2 CYP 1A1基因Msp I多态性的分布比较结果

表3 维吾尔族人群中，按COMT基因G/G基因型分组后CYP 1A1基因多态性和PD的相关性分析

表4 在年龄≥60岁人群中，按COMT基因G/G基因型分组后，CYP 1A1基因多态性和PD的相关性分析

3 讨论

COMT基因第4外显子的第1947核苷酸存在G/A多态性造成氨基酸Val108 Met突变，该多态可改变COMT的活性，其中Val(G)的活性比Met(A)高3～4倍。不同活性的基因型对体内DA的代谢影响不同。Bishop等［14］发现人体内Val等位基因数量越多，其体内DA降解越快，而 Met等位基因则相反。Honea等［15］发现COMT基因Val等位基因者的整个脑容积较其他型有明显减少，并提示COMT基因多态性对脑灰质的影响可能与DA水平改变引起的神经毒性有关。同时，COMT酶选择性抑制剂在治疗PD中有益，提示COMT在PD的病理生理过程中可能发挥作用。我们的研究结果显示新疆地区COMT基因 G/A多态性与PD的危险性无关。Boudikova等［16］的研究发现女性红细胞和肝脏中COMT酶活性较男性低20% ～30%;而 Gulderberg等［17］报道从出生到成年，大鼠肝脏中COMT酶活性将增加10倍，提示性别、年龄对COMT酶活性有一定的影响，故我们进一步按照性别、年龄进行分组，发现无论是在男性人群、女性人群，还是在年龄≥60岁人群中，都不存在COMT基因G/A多态与PD相关。我们的研究结果与针对中国人群的徐玲等［18］和 Xie等［19］、针对芬兰人群的 Eerola J等［20］发现的COMT基因G/A多态与PD的遗传易感性不存在相关性的结论基本一致，而与针对中国人群的邵明等［4］和张莉等［5］、针对日本人群的 Yoritaka A 等［6］和Kunugi H等［7］的研究所发现的COMT G/A多态与PD的发生具有明确相关性的结论不同。

CYP1A1基因定位于15q22-q24，是细胞色素P450家族成员之一，是外源性化学物质在体内代谢的重要的一相酶之一，可催化多种外源性和内源性复合物降解。Morse等［21］研究发现在脑膜和脑室周围组织(如脉络膜丛、松果体等)有CYP1A1酶的分布，发挥其对渗入的外源性毒物的代谢和解毒作用。CYP1A1基因3’端多a信号下游第264个碱基T基换为C，形成 MspⅠ酶切位点。Takakubo等［8］对日本散发性PD患者的研究发现，C基因型的存在使PD的危险度提高了2.34倍。而我们的研究发现，其与新疆地区PD的易患性无关。CYP 1A1也是雌激素代谢相关酶，提示其活性受性别、年龄因素的影响，故我们进一步按照性别、年龄进行分组，发现无论是在男性人群、女性人群，还是在年龄≥60岁人群中，都不存在CYP1A1基因MspⅠ多态性与PD的相关。这与我国刘平等［22］的研究结论基本一致，而与王建等［9］的研究不同，其发现CYP1A1基因MspⅠ多态性与早发型PD的易感性相关。

PD的发生和发展是极其复杂的过程，它很可能是一种由多基因决定和受多种环境因素影响的疾病。已经有研究发现COMT基因多态性可能与单胺氧化酶 B(monoamine oxidase B，MAOB)基因［10］、多巴胺β羟化酶(dopamine beta hydroxylase，DBH)基因［11］多态性间的协同作用增加PD的发生危险，而CYP 1A1基因多态性也可通过与N-乙酰转移酶2(n-acetyltransferase 2 gene，NAT2)基因［12］多态性间的共同作用增加PD个体的易患性。本研究中，我们发现，当COMT基因、CYP 1A1基因单独作用时，其多态性均与PD的遗传易感性不相关。而当我们将二者综合起来分析时，发现COMT G/G基因型和CYP 1A1 T/T基因型间的协同作用可使新疆维吾尔族人群中PD的发生风险增加3.288倍，而COMT G/G基因型与CYP 1A1 T/C基因型间的协同作用可分别使新疆维吾尔族人群中、年龄≥60岁人群中PD的发生风险下降0.245倍和0.451倍。我们并不能解释我们的研究结果，最主要的原因可能是PD是多位点基因及环境因素相互作用的结果，一种基因或者两种基因的联合作用并不能完全决定PD的发生发展，另一原因是不同民族PD的易感基因不同。

PD的病因复杂，至今尚没有一种理论能够解释其病因，通过多种相邻位点的基因或作用相关蛋白的编码基因的联合分析，才能找到疾病发生的关键所在。酶的活性并不完全取决于基因结构，基因转录调控和底物对酶的诱导活性都将对其产生一定的影响，因此，某一基因突变的存在以及多个基因之间的相互作用，都可能影响疾病的发生和发展进程。我们的结果从另一个侧面阐明了PD的遗传异质性和病因的复杂性。深入探讨相关基因多态性、相关基因-环境因素的联合检测，提高个体PD易患性的预测水平，这些都还须进一步研究。

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