雌三醇及拮抗剂三苯氧胺对兔耳瘢痕增生的影响

窦孝康

(黔西南州人民医院 普外烧伤科，贵州 兴义 562400)

瘢痕是因物理、生物、化学等因素的作用导致皮肤软组织损伤而不能完全自行正常修复，转由纤维组织替代修复遗留的病理状态。适度的瘢痕形成是一种生理性和自卫性表现，而过度增生则属于病理状况。瘢痕组织的生成包括3个步骤:①肉芽组织形成将创腔填满，创面铺垫平整。②创缘的向心性收缩，牵拉四周正常皮肤向内移动使边缘互相接近。③上皮再生，源于创面的皮肤表皮的新生上皮细胞向创面中心聚拢推进，逐渐覆盖肉芽组织，形成皮肤瘢痕，创面最终愈合。从病理学角度可将瘢痕分为3类:正常皮肤瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。后2者均属于病理性增生，其发生机制至今仍不明确，因此难以有效治疗。目前的治疗方式有通过加压、药物、放射、激光、冷冻、中医药手术等，但没有一种方法能完全地避免或消除瘢痕。

近年来由于细胞生物学和分子生物学的发展，对瘢痕的研究取得了一定进展，尤其是一些与瘢痕相关的生长因子及信号传导通路的发现，为治疗瘢痕提供了新的思路。在众多细胞因子中，TGFβ因与瘢痕增生关系密切，一直是研究的热点之一。本研究旨在通过构建兔耳瘢痕模型，采用雌三醇作为瘢痕增生的促进剂并以三苯氧胺作为拮抗剂，通过大体标本的观察、HE染色及免疫组化方法，观察其对兔耳瘢痕模型的影响，探索雌三醇与瘢痕增生、三苯氧胺抑制瘢痕增生的关系，以及对TGF-β1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰大耳兔24只，体质量为2.2～2.8 kg，兔龄在2～4月，均为雌性，分笼人工饲料饲养。本实验严格遵循《实验动物管理条例》。实验动物由贵阳中医学学院实验动物中心提供(动物合格证号2001A032)。

1.2 实验方法

1.2.1 兔瘢痕模型构建:将大耳兔随机分成3组:雌三醇组、三苯氧胺组、对照组。每只兔耳制作6个直径1.2 cm圆形标记，间隔约1 cm。24只兔子共制作288个创面。2周后，兔耳打孔处出现圆形瘢痕，为兔瘢痕模型构建成功。

1.2.2 实验给药:雌三醇组用雌三醇乳膏(默沙东制药有限公司，国药准字H20091091)外涂。涂抹剂量为每孔为0.0015mg，每天1次;三苯氧胺组除用以同样剂量雌三醇乳膏外涂外加用三苯氧胺(杨子江制药公司，国药准字H32021472)，10mg/d喂服;对照组未用药。

1.3 实验指标采集

1.3.1 各组标本中瘢痕形态:麻醉后切取每只兔左耳外侧近耳尖部第一个瘢痕组织以4%甲醛固定，常规石蜡包埋。观察并拍照，对比实验组和对照组瘢痕的表面、质地、厚度、色泽及是否有皮钉存在。

1.3.2 瘢痕指数的测定:将HE染色石蜡切片放置于光镜下，在100倍镜下用计算机图像分析系统测量创面上皮化后的真皮厚度和邻近正常组织的真皮厚度，计算瘢痕指数，按照下列公式［2］。

1.3.3 免疫组化结果分析:瘢痕组织中含大量TGF-β1，在成纤维细胞细胞质或细胞膜中呈现棕黄色或红褐色为阳性表达。选用染色细胞数及染色强度综合评分方法(IHS法)［3］进行统计评分。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0分析处理数据，正态计量资料用“±s”表达，其中两两间均数比较采用配对t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔瘢痕模型建立 24只兔子共制作288个创面(图1左)。2周后，所有创面均愈合，上皮化完成，兔耳打孔处出现了圆形瘢痕，288处创面均出现瘢痕，无流脓流液(图1右)。

图1 兔瘢痕模型构建Fig.1 Construction of rabbit hypertrophic scars model

2.2 术后2周标本中呈现的瘢痕增生情况

2.2.1 大体标本:2周后观察3组瘢痕大体标本，雌激素组瘢痕稍高出皮肤表面，质地中，色泽偏红;苯氧胺组、对照组瘢痕情况同雌激素组(见图2)。3组的表面、质地、色泽、厚度、直径及皮钉数目无明显差异(见表1)。

图2 3组瘢痕增生情况比较Fig.2 Comparasion of scar hyperplasia among three groups

表1 3组瘢痕大体标本表现Tab.1 Performance of scar gross in three groups

2.2.2 术后2周3组瘢痕指数测定结果:雌激素组测量的瘢痕指数为1.55±0.34;三苯氧胺组测量的瘢痕指数为1.66±0.18，空白对照组测量的瘢痕指数为1.49±0.25。3组瘢痕指数两两比较均无显著性差异。

2.2.3 术后2周3组瘢痕组织光镜下HE染色结果:光镜结果显示:3组均有成纤维细胞增生，胶原纤维沉积，并可见淋巴细胞、桨细胞以及中性细胞浸润，比较无显著性差异(见图3)。

图3 术后2周3组瘢痕组织光镜下HE染色结果(×400)Fig.3 HE staining results of scar tissue in three groups posrview at 2 weeks(×400)

2.2.4 3组瘢痕组织免疫组化检测结果:TGF-β1主要在成纤维细胞细胞质中表达，雌激素组、三苯氧胺组及对照组的TGF-β1在兔耳瘢痕中均多呈低表达反应，强阳性表达很少(见图4)。TGF-β1在各组瘢痕中的强阳性表达及积分情况见表2。

图4 3组瘢痕组织TGF-β1免疫组化检测结果Fig.4 Immunohistochemical detection results of TGF-beta 1 in scar tissues of three groups

表2 二周时TGF-β1在各组瘢痕中的强阳性表达情况以及IHS在各组的积分Tab.2 Strong positive expression of TGF-β1 and the integral IHS in each group after two weeks

2.3 术后5周3组标本中呈现的瘢痕增生情况

2.3.1 术后5周3组瘢痕大体情况:雌激素组可见瘢痕明显高出于皮肤表面，增生比较明显，表现为质地较硬，色泽偏红，大部分创面中央区出现较大皮钉，而三苯氧胺组瘢痕与皮肤表面相平，增生不明显，表现为质地软，色泽偏淡，皮钉数目少而且较小，对照组瘢痕与三苯氧胺组类似(见图5)。瘢痕大体表现数据统计见表3。

图5 术后5周3组瘢痕大体情况Fig.5 General situation of scar in three groups posrview at 5 weeks

表3 瘢痕大体表现统计表Tab.3 Performance of scar gross in three groups

2.3.2 术后5周瘢痕指数的测定:雌激素组瘢痕明显高过周围皮肤表面，瘢痕指数为2.25±0.34;三苯氧胺组瘢痕较为扁平，瘢痕指数为1.64±0.25;空白对照组瘢痕也呈现为扁平瘢痕表现，瘢痕指数为1.09±0.18。雌激素组瘢痕指数显著高于空白对照组(P＜0.05)。三苯氧胺瘢痕指数显著低于雌激素组(P＜0.05)。

2.3.3 术后5周3组瘢痕组织HE染色结果:雌激素组瘢痕组织中胶原纤维增多，排列杂乱，血管数目增多，成纤维细胞大量增多，淋巴细胞、浆细胞以及中性白细胞增多。三苯氧胺组瘢痕组织中胶原纤维减少，成纤维细胞较少，血管数目少，排列整齐，淋巴细胞、浆细胞以及中性白细胞减少。对照组介于2者之间(见图6)。

图6 术后5周3组瘢痕组织HE染色结果(×400)Fig.6 HE staining results of scar tissues in three groups posrview at 5 weeks(×400)

2.3.4 术后5周3组瘢痕组织免疫组化结果:雌激素组TGF-β1在兔耳瘢痕中呈高表达，在三苯氧胺组及对照组中均呈低表达(见图7)。TGF-β1在各组瘢痕中的阳性表达情况及程度见表4。

图7 术后5周3组瘢痕组织免疫组化结果Fig.7 Immunohistochemical results of scar tissues in three groups posrview at 5 weeks

表4 5周时TGF-β1在各组瘢痕中的强阳性表达情况以及IHS在各组的积分Tab.4 Strong positive expression of TGF-β1 and the integral IHS in each group after 5 weeks

3 讨论

由本实验结果可知:雌三醇乳膏对兔耳瘢痕有促进增生的作用，并与TGF-β1表达同步。三苯氧胺可以抑制雌三醇引起的兔耳瘢痕增生。三苯氧胺组与对照组比较，除TGF-β1表达明显少于对照组外，2组其他结果均接近，是否三苯氧胺除阻止雌激素刺激瘢痕增生外还有其他抑制瘢痕增生的机制呢?目前尚不能下定论。雌三醇对兔耳增生性瘢痕模型的建立与改进有重要意义。

雌激素属脂溶性激素，可以透过细胞膜，经细胞质、再经过核膜而进入核内，以核蛋白作为受体，直接在染色质上改变受体的构象而发挥作用［4-5］。雌激素对子宫内膜和平滑肌的代谢有明显促进作用。刺激阴道上皮基底层细胞增生、分化、成熟以及角化和引起核致密变化，刺激人类乳腺导管的生长和乳腺腺泡的发育［6-7］。

三苯氧胺在兔耳瘢痕增生中主要表现为抑制作用，它可以抑制成纤维细胞的增殖，并且还能抑制胶原的沉积。李兵等［8］和胡大海等［9］报告显示三苯氧胺还可以抑制瘢痕成纤维细胞DNA及胶原的合成。本实验中，三苯氧胺组对瘢痕也同样表现出抑制作用，大体标本表现为瘢痕厚度变薄、质地变软、色泽偏暗、皮钉数目较少;光镜下表现为成纤维细胞数目较雌激素少，胶原沉积少;免疫组化结果显示TGF-β1呈现低表达，IHS积分较对照组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

在哺乳动物机体内，有多种细胞分泌非活性状态的TGF-β，非活性状态的TGF-β通过酸化可被活化。在哺乳动物体内发现了3 种亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1、TGF-β2与瘢痕增生有密切关系。TGF-β1能够加速成纤维细胞增殖，刺激胶原等胞外基质的沉积，趋化巨噬细胞向伤口聚集，诱导肉芽组织的生长，在促进创面修复以及修复后组织改建过程中起重要作用。从本次免疫组化结果可见:TGF-β1在雌三醇组的表达明显高于三苯氧胺组及对照组，呈现高表达反应，表现在成纤维细胞的细胞质中呈现为多量、成片的棕黄色，并能见到大量的胶原沉积，说明雌激素导致的瘢痕增生与TGF-β1有关。而在三苯氧胺组TGF-β1呈现低表达反应，在成纤维细胞分布区域表现为少量，小片状棕黄色，且胶原沉积较少，说明TGF-β1减少与瘢痕抑制有一定的相关性。

除此之外，兔耳瘢痕模型制作对于研究瘢痕形成、发展、增生有重要意义，虽已有许多研究，但目前仍以兔耳瘢痕模型为佳，本实验可见局部使用雌三醇乳膏可导致明显的增生现象，而三苯氧胺能抑制雌激素引起的兔耳瘢痕增生。然而是否可将在局部使用雌激素作为制作增生性瘢痕模型的方法是值得商榷的。本实验不足在于样本例数少、时间短，检测指标较简单，进一步结论还有待后续研究。

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