金黄色葡萄球菌三种定量检验方法的比较

刘海卿，佘之蕴，陈丹玲，李姣，苏妙仪，张施敬，王力清

（广东产品质量监督检验研究院，广东顺德528300）

金黄色葡萄球菌（StaphyLoccocus aureus）是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一，据美国CDC报告，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希氏菌，居第2位，占细菌性食物中毒的33%[1]。国际上一般认为金黄色葡萄球菌≥105CFU/g就会产生肠毒素，发生金黄色葡萄球菌肠毒素中毒，会出现恶心、剧烈反复呕吐症状，并伴有上腹痛及腹泻，体温一般不高，1 d～2 d可恢复[2]。国际食品微生物规格委员会（ICMSF）已对金黄色葡萄球菌的危害度进行评估，将其列为中度直接局部传播性病原菌。目前，世界各国都把金黄色葡萄球菌检测列为食品卫生的法定检测项目[3]。

常用金黄色葡萄球菌的定量检测方法有三种：GB 4789.10-2010、SN/T 1895-2007 和 Baird-Parker琼脂+RPF（兔血浆）快速培养法，这些方法各有利弊。GB 4789.10-2010实验步骤分四步，时间上约需78 h，SN/T 1895-2007和快速培养法只需一步，24 h可获得检测结果。本文将这3种方法对不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液进行定量检测，进而比较总结，在不同食品污染程度时，适当选择，对快速、准确检测出金葡菌含量有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和菌悬液的制备

金黄色葡萄球菌[ATCC 6538]。

取-70℃条件下保存于含15%无菌丙三醇的金黄色葡萄球菌，转种至第二代营养琼脂斜面，用0.85%生理盐水稀释，制备1.0麦氏浊度单位的菌悬液，再用0.85%生理盐水梯度稀释。

1.1.2 培养基和试剂

7.5%氯化钠肉汤；Baird-Parker平板：广州环凯技术生物有限公司。兔血浆：青岛海博生物技术有限公司。3MPerifilmTM金黄色葡萄球菌测试片：美国3M公司。Baird-Parker琼脂+RPF（兔血浆）：生物梅里埃公司。

1.1.3 仪器设备

高压灭菌锅：日本ALP。隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌国标检测方法

GB 4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》第二法[4]。

1.2.2 金黄色葡萄球菌快速检测方法

SN/T 1895-2007《食品中金黄色葡萄球菌的快速计数法PetrifilmTM测试片法》[5]。

1.2.3 Baird-Parker琼脂+RPF（兔血浆）快速培养法

培养基配制：先将R1（Brird-Parker琼脂）瓶中的琼脂在100℃的水浴中约45 min溶解，将R1室温放置至少15 s，而后将其放入45℃的水浴设备保温，另外加10 mL室温无菌水至R2试剂（RPF兔血浆）中，将其溶解后加入已降温至45℃的R1，立即旋转混匀。

接种培养：取每个稀释度的菌液1 mL于无菌培养皿中，每个稀释度做两个平皿，及时将20 mL混匀后的培养基倾入平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后翻转平板，置于培养箱，（36±1）℃培养（24±2）h，结果以CFU/mL表示。

1.2.4 三种方法比较

三种方法检验流程及典型菌落形态确认见表1。

表1 三种方法比较Table 1 Comparison of three kinds of test process

1.3 统计方法

所得数据用SPSS19.0进行方差分析。

2 结果

选用三个稀释度的菌悬液，100CFU/mL～103CFU/mL浓度检验结果见表2。

表2 三种方法检测100CFU/mL～103CFU/mL浓度金黄色葡萄球菌悬液的结果Table 2 Results of the three methods in determining the concentrationofS.aureusintheconcentrationof100CFU/mL-103CFU/mL

在103CFU/mL浓度时三种方法的平均值相差较大，因此增加此梯度的平行试验，三种方法检测103CFU/mL浓度金黄色葡萄菌悬液的10个平行结果见表3。

表3 三种方法检测103CFU/mL浓度金黄色葡萄球菌悬液的结果Table 3 ResuLts of the three methods in determining the concentration of S.aureus in the concentration of 103CFU/mL

经统计学分析在103CFU/mL菌悬液浓度范围时，SN/T 1895-2007与Baird-Parker琼脂+RPF（兔血浆）快速培养法结果接近（P=0.712＞0.05），GB 4789.10-2010与另外两种方法结果有显著差异（P=0.000＜0.05），另外GB 4789.10-2010的计数结果值较高。

3 讨论

1）在低于103CFU/mL浓度时3种方法结果无明显差异，对非仲裁检验单位有十分重要的实际意义，SN/T 1895-2007方法和Baird-Parker琼脂+RPF（兔血浆）快速培养法方便易行，避免了GB 4789.10-2010方法多个步骤的繁琐环节，操作简便，且检测时间较短，便于加工企业每批样品抽检。但相比于GB 4789.10-2010，这两个方法的耗材较贵，检验成本较高。

2）金黄色葡萄球菌在Baird-Parker琼脂+RPF（兔血浆）培养基上生长良好，阳性菌呈黑灰色，周围沉淀环明显，此结果易与其他形态菌落区分，结果易判读便于计数。

3）在实际的检测工作中，对不同样品进行检测时，应注意根据实际金黄色葡萄球菌污染程度选择合适的方法，这样既可提高检测速度，又可确保检测结果的准确性。