南极磷虾油的气相色谱指纹图谱和聚类分析

刘建君，汪胜福，门敬菊，郭忠，冯迪娜，王嘉麒，吕晶

（1.辽宁省大连海洋渔业集团公司技术中心，辽宁大连116113；2.中国人民解放军第210医院临床药理基地，辽宁大连116011）

南极磷虾（Antarctic krill）学名 Euphausia superba，属于动物界节肢动物门，甲壳亚门软甲纲、磷虾目、磷虾科。其富含蛋白质、磷脂、虾青素、甲壳素、酶等营养成分与活性成分；提取出来的南极磷虾脂类所含的脂肪酸种类多，且多为不饱和脂肪酸，尤其EPA和DHA含量较高[1]。故而，南极磷虾近年来引起国内外广泛关注。随着消费者需求量的不断增加，市场上出现的南极磷虾油品种繁多，鱼龙混珠现象时常出现，品质存在较大差异，严重损害消费者利益，因此，建立南极磷虾油产品品质的真伪优劣的分析方法，对于当前南极磷虾产品的质量控制具有极其重要的意义。中药指纹图谱（TCMF）作为中药及其制剂质量控制的有效手段，已受到了中药界的广泛关注，同时也是被国内外广泛接受的一种有效的中药材品种鉴定、产地溯源和质量控制手段，而色谱和光谱技术是研究中药指纹图谱的两种主要方法，例如：高效液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等方法已经用于TCMF的研究；色谱TCMF因其具有宏观、综合、模糊和非线性等特性[2]，须借助计算机对其进行数据分析，聚类分析和人工神经网络等数据的解析方法已用于该研究。

在南极磷虾油甲酯化前处理的基础上，对10批南极磷虾油样品进行指纹图谱和聚类分析的模式识别研究，建立南极磷虾油气相指纹图谱分析方法，为来自南极洲不同海域、生产国及厂家的南极磷虾油鉴别与质量评价提供新途径。

1 材料与方法

1.1 试样及试剂

南极磷虾油：辽宁省大连海洋渔业集团公司；EPA/DHA甲酯标准品（纯度≥99%）：美国SIGMA公司。异辛烷、正己烷、甲醇均为色谱纯；氢氧化钾、浓硫酸为分析纯；2 mol/L KOH-甲醇溶液、2 mol/L硫酸-甲醇溶液：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器及设备

7820A型气相色谱仪（附氢火焰离子化检测器）：美国 Agilent公司；AL204型电子天平（0.1 mg）：（梅特勒-托利（Metter Toledo）公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机：长沙湘智离心机仪器公司。

1.3 色谱条件

色谱柱：HP-88型石英毛细管柱，100 m×0.250 mm×0.20 μm；摸索出最佳色谱程升条件：120 ℃，5 min，5℃/min到 175℃，10 min，5℃/min到210℃，5 min；5℃/min到230℃，10 min；总时长52 min；进样口温度：250℃；FID检测器温度：270℃；进样方式：分流，分流比 10∶1；进样量：1 μL；载气：高纯氮气（99.999%）。

在以上色谱条件下，33种标准物质成分实现基线分离，保留时间精密度RSD＜1.0%，各组分峰面积精密度RSD＜1.5%；其余4种组分分离度小于1.5，即：γ-亚麻酸与花生酸保留时间在32.600 min（RSD为0.78%）；二十二碳酸与二十碳三烯酸保留时间在37.331 min（RSD为0.67%），气相色谱图详见图1。

图1 37种脂肪酸甲酯混合标准品在HP-88型毛细管柱上的气相色谱图Fig.1 37 kinds of mixed fatty acid methyl esters standards in GC using HP-88 capillary column

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度试验

取同一份供试品溶液，连续进样5次，检测指纹图谱。结果表明，其相对保留时间RSD＜1.0%，主要共有峰相对峰面积比值的RSD＜1.0%，符合指纹图谱要求。

1.4.2 重现性试验

取同一批样品5份，制备供试品溶液，检测指纹图谱。结果表明，其相对保留时间RSD＜1.0%，主要共有峰相对峰面积比值的RSD＜2.0%，符合指纹图谱要求。

1.4.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别在 0、2、6、18、12 h 检测指纹图谱。结果表明，其相对保留时间RSD＜1.0%，主要共有峰峰面积的RSD＜2.0%，符合指纹图谱要求。

1.4.4 共有特征峰的筛选

以L20130729E01批南极磷虾油为参照对象，进行特征峰筛选，筛选结果如下：确定出13个共有特征峰，分别是：肉豆蔻酸、十五碳酸、棕榈酸、棕榈油酸、组分D、硬脂酸、油酸、组分E、亚油酸、α-亚麻酸、二十一碳酸、EPA、DHA。见图2和表1。

图2 L20130729E01批南极磷虾油的气相色谱图Fig.2 The gas chromatogram of L20130729E01 batch antarctic krill oil sample

表1 南极磷虾油13个特征峰的信息Table 1 Antarctic krill oil 13 mark peaks information

通过在HP-88毛细管柱及以上优化色谱条件，达到较好的组分峰分离效果，从而，选出13个共有特征组分峰，进行以下数据统计，10批南极磷虾油甲酯化样品归一化法各组分的百分面积信息，见表2。

2 色谱指纹图谱相似度评价及聚类分析

2.1 中药色谱指纹图谱相似度评价系统（A版）评价南极磷虾油的相似度

将10批南极磷虾油的气相色谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会2004A版）》，通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，生成南极磷虾油的色谱指纹图谱共有模式，见图3。

在分析检验模式下，以L20130729E01批南极磷虾油样品图谱作为参照图谱，进行相似度计算与评价，结果见表3。

相似度结果情况：批号N20130724E01样品相似度为0.906，相似度最低，其次是N20130724E02样品为0.953，其余8批样品相似度均大于0.955；图谱的相似度评价作为一种系统性、综合性的判定指标，为南极磷虾油的品质控制提供了一个有效的参考方法。

表2 10批南极磷虾油样品面积归一化法各组分的数据Table 2 The peak area normalization method of each component data about 10 batches of antarctic krill oil

表3 10批南极磷虾油的GC指纹图谱相似度评价Table 3 The GC Fingerprint Similarity Evaluation of 10 batches of antarctic krill oil

图3 10批南极磷虾油的GC指纹图谱Fig.3 The GC fingerprints of 10 batches of antarctic krill oil

2.2 基于脂肪酸成分的系统聚类分析鉴别

本实验采用SSPS19.0聚类分析软件包，包括系统聚类、模糊聚类、图论聚类等多种聚类分析方法；本文选择系统聚类的最近邻元素、组间距离法（Betweengroups linkage）和欧氏距离平方（Squared euclindean distance）处理各批次样品的色谱数据，进行聚类分析，其分析结果见表4和图4。

表4 10批南极磷虾油样品系统聚类分析数据Table 4 The clustering analysis data about the 10 batches of antarctic krill oil

图4 10批南极磷虾油样品系统聚类分析图Fig.4 The figure of genealogied cluster analysis about the 10 batches of antarctic krill oil

通过最近邻元素、组间距离法的聚类分析可以看出，10批样品的结果如下：组间距离法的结果：当欧氏距离d大于13时，可分为三类，即：1、4与5为一类（d≤2）；7、8、9、10 为一类（5＜d＜10），2、3、6 聚为一类（13＜d≤15）。因此，L20130729E01、X-20130528E01、X-20130707E01这3批聚为一类（d≤2），而且d值最小，这说明所用南极磷虾原料为2011年与2012年的鲜品冻虾，贮存时间较长，且接近；X-20130812E01、F20130807E01、F20130808E01、F20130812E01 四批聚为一类（5＜d＜10），其中三者甚为一致，说明这 3 批南极磷虾油均为2013年的鲜品冻虾原料提取，另外X-20130812E01这批明显有一定区别，是南极磷虾干粉醇提得到的磷虾油；N20130724E02、N20130724E01、X-20130807E01这3批聚为一类（13＜d≤15）；说明N20130724E02、N20130724E01批次南极磷虾油提取工艺与其他8批次提取工艺有所不同；但通过X-20130807E01这批精提工艺的样品可以看出，N20130724E02和N20130724E01两批磷虾油很接近。

4 结论

综上看来，基于HP-88型石英毛细管柱的气相色谱信息，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（A版）》与IBM的SPSS19.0权威统计学软件共同对南极磷虾油的13个共有特征组分峰进行分析，可以看出：通过比较对照品的方法，已确定的南极磷虾油指纹图谱中13个共有的指纹峰中6个不饱和脂肪酸成分在南极磷虾油指纹图谱中的峰面积占总指纹峰峰面积的43%以上，其中n-3多不饱和脂肪酸（EPA、DHA）达20%以上，均具有很强的代表性和特征性。

南极磷虾油经过指纹图谱法的测定后，从相似度的计算和聚类分析结果可以看出，不同工艺和原料贮存时间长短，对南极磷虾油品质上有一定的差别。随着今后的研究，样品量逐步增多，在HP-88型石英毛细管柱的色谱信息量加大，可以建立南极磷虾油气相色谱指纹图谱鉴定信息系统。

指纹图谱是现代分析中常用的手段之一，它能够较充分得到某提取物质独特的信息[3]。系统聚类分析作为化学计量学方法的一种，能够找到隐藏在众多共性下的差异，对提取的数据进行充分的多元分析。二者结合起来使用为南极磷虾油来源的识别及质量评价提供了新的思路和模式；将指纹图谱法与相似度和聚类分析相结合来综合评价南极磷虾油质量，其判断结果更科学、更全面、更符合实际情况；从而为南极磷虾的规范化捕捞、南极磷虾来源的认证和生产过程控制及南极磷虾油产品真伪优劣的甄别提供技术参考。