起泡法制备HA泡沫陶瓷以修复甲状软骨损伤

汪伊丽 黄彦天 刘增述 曹高翔 夏 薇

甲状软骨密切关系着生物体的饮食与语言交流等重要活动，其损伤修复备受关注。目前国内外临床医学上多采用传统的“以创伤修复创伤”的治疗模式，利用临近皮瓣、带肋骨的肌皮瓣等修复人体甲状软骨损伤。这种方式来源、大小形状受限，支撑力可能不足，对人体其他组织也带来了缺陷［1］。为此，借鉴国内外利用HA陶瓷在牙周骨质、药物载体、生物硬组织等领域的运用［2－3］，本组提出了一种新的甲状软骨支架结构设计和制造方法。通过CT扫描，利用CAD三维重建缺损的甲状软骨支架，应用RP技术实现支架结构的精确可控制造。试图将具有良好生物相容性的羟基磷灰石生物陶瓷［4］延伸运用于生物软骨上，添加软骨形成诱导因子骨形态发生蛋白－2及I型胶原［5］，以期制造出近似原生物体甲状软骨的带有循环微孔的人工骨架。其开孔结构有助于软骨生长因子和组织液的流动循环，利于营养元素的交换与输送，从而促进新生骨的生长并与原体组织的融合［6］，力求最大限度地保留生物体的甲状软骨功能。

1 材料与方法

1.1 实验药品 羟基磷灰石(HA)，北京德科岛金科技有限公司;丙烯酰胺(AM)，上海源叶生物科技有限公司;N，N'－亚甲基双丙烯酰胺(MABM)，天津市科密欧化学试剂有限公司;柠檬酸铵，天津市科密欧化学试剂有限公司;过硫酸铵(APS)，国药集团化学试剂有限公司;四甲基乙二胺(TEMED)，国药集团化学试剂有限公司;Trition－114，美国Spectrum化学试剂公司;纯水;无水乙醇;水溶性I型胶原;重组人骨形态发生蛋白－2。

1.2 直接起泡法制备开孔羟基磷灰石泡沫陶瓷 按照质量比，纯水∶AM∶MABM=20∶15∶1 配制基液，实验中考虑到电子恒速搅拌机(额定功率为800W)的容量，取纯水体积60 ml。向其中添加31.6 g羟基磷灰石制取若干组理论固相含量为16.67%的陶瓷浆料。球磨45 min，将浆料转移至搅拌机中，加入2.5 ml起泡剂Trition－114，搅拌约8～12 min，使得浆料充分发泡，发泡后体积约为原体积的2～3倍。继续加入过硫酸铵1.0 g，搅拌约3～5 min。最后添加催化剂TEMED约30滴(合约1.5 ml体积，采用普通胶头滴管)，搅拌约2～3 min，由于反应放热，存在气体挥发，搅拌完毕应即时打开容器盖。浆料反应结束，形成具有微小孔隙的多孔泡沫坯体。

将多孔泡沫坯体室温下放置24h风干;其后放置炉中缓慢加热至100～120℃，保温24 h烘干;最后将烘干后的多孔泡沫坯体放入马弗炉内进行烧结:以1℃/min的速率缓慢升温至300℃，保温2 h;再以3℃/min的升温速度加热至1 200℃，保温2 h。获得一定孔隙率的开孔羟基磷灰石泡沫陶瓷。

1.3 羟基磷灰石泡沫陶瓷孔隙率和强度的测定方法 这里依据阿基米德原理，采用排液法测定羟基磷灰石泡沫陶瓷标准样件的孔隙率。用量筒量取足量体积(V1)的无水乙醇，将准备好的标准样件放入其中，确保其完全浸入无水乙醇中。密封量筒，静置数分，待样件表面无明显气泡，记录此时的量筒读数(V2)。将样件取出，记录量筒中无水乙醇的读数(V3)。则标准样件的体积V、孔隙率K，按照下列公式进行计算:［7］

将羟基磷灰石泡沫陶瓷切成5×5×3(单位:mm)的正方形薄片，利用电镜对孔隙进行电镜扫描观测。另将泡沫陶瓷切成标准样件，在万能力学测试机下进行抗压强度检测。

1.4 凝胶注模法制备个体化泡沫陶瓷甲状软骨复合支架通过对生物体甲状软骨的CT扫描数据，CAD三维重建制备个性化的甲状软骨支架模具。基于上述成熟的HA泡沫陶瓷制备技术，适当修改HA泡沫陶瓷浆料的固相含量(体积比)，在准备好的个性化甲状软骨支架模具内进行凝胶注模，脱模后即可获得所需形状、尺寸大小的泡沫陶瓷软骨支架。添加重组人骨形态发生蛋白－2及Ⅰ型胶原，通过冷冻吸附法最终获得个性化的骨形态发生蛋白－复合胶原羟基磷灰石人工甲状软骨复合支架。

1.5 人工复合骨架应用于动物甲状软骨损伤修复的测试实验 培育新西兰大白兔若干，编号后均分A、B两组。对所有大白兔进行甲状软骨缺损手术。A组术后不做其他处理。B组为缺损区植入个性化的人工甲状软骨复合支架。术后定期性地分别对两组动物进行观察。记录动物饮食、出声及术口等现象。并随机分别抽取出A、B组动物甲状软骨及其周边组织制成标本，医学电镜下观测A组软骨缺损区的骨组织生长情况及B组植入骨架与动物骨组织的结合情况及新生骨的生长状况。

2 实验结果与讨论

2.1 泡沫陶瓷起泡反应分析 泡沫陶瓷，顾名思义其主要特征就是具备了具有高温特性的多孔特性。为了实现泡沫陶瓷的多孔特性，本研究采用了起泡反应的方法。而此法的关键就在于起泡剂的选取及其分量的控制。各种表面活性剂的分子结构都可看做是由亲油基和亲水基两部分组成，但其亲水亲油程度有所差异，即HLB值不同。依据所需性质和应用场合的不同，需要挑选具有合适亲水亲油结构及相对密度的表面活性剂。控制其配比，从而达到控制亲水亲油平衡的目的［8］。本例中选择非离子型表面活性剂TritionX－114，利用其分子对两相不同的亲和力，达到两相表面融合于TritionX－114分子内部的效果，从而降低两相界面张力，稳定气泡。

这里采用滴体积法对调试好的HA浆料进行表面张力测试实验［9］。

图1 纯水校验及浆料的表面张力测试结果

图1HA浆料配比为，H2O:5 ml、TritionX－114:0.5 ml、HA:3.16 g。由图1可以形象地看出添加了表面活性剂TritionX－114的浆料其表面张力明显降低，当然HA也对表面张力值存在一定程度的影响，这里不深入讨论。只是想通过图表更清晰地表达TritionX－114达到了预期想要的效果。

至于起泡剂量的控制，过少的起泡剂使得浆料的起泡效果不佳，过多的起泡剂又会致使浆料形成胶团孔隙不均。所以应尽量控制比例使浆料接近临界胶束浓度，此时浆料的表面张力接近最低值［10］。在上述实验的配比中，虽未能证明该比例的起泡剂的量为最佳值，但是通过对孔隙形状尺寸大小的观测以及孔隙率的理论计算，符合实验结果需求即可。

2.2 HA泡沫陶瓷孔隙观测和力学强度的分析 图2中可以清晰地看到制备的泡沫陶瓷孔隙为不规整的三维立体网络开孔结构，孔隙尺寸从100～600 μm不等，集中于150 ～300 μm 范围内。

图2 HA泡沫陶瓷的孔隙尺寸形貌

由于羟基磷灰石具有较低的力学性使其使用范围受限［11］，尤其在人工骨方面，由于人体的生物排异性，轻易在羟基磷灰石中加入增强相以提高其力学强度，可能会给生物体带来不可忽视的副作用。而本项实验采取的起泡法是建立在凝胶注模的基础上。只是通过单体和交联剂的凝胶反应，从而建立了三维网格结构，由此增强了HA陶瓷的力学强度。通过强度测试显示，在如此相对较低固相的情况下，HA陶瓷支架的生物力学强度可达2.3 mPa。

2.3 HA泡沫陶瓷甲状软骨支架孔隙率的测定 通过多组HA陶瓷甲状软骨支架进行孔隙率实验测定，结果表明，参照上述的实验流程，适当调节配比，定量纯水质量60 g，取质量比纯水:AM∶MABM∶APS=18∶15∶1，反应剂 1.2 g，催化剂TEMED约1.8 ml体积，制得若干固相含量为25%的陶瓷软骨支架其孔隙率最高可达81.34%，平均孔隙率近似为74.37%。

图3 多孔HA陶瓷的孔隙率

图3展示了由排液法测定而得的若干数组实验数据经计算最后所得的孔隙率。其最高值为81.34%，最低值为67.11%，平均孔隙率近似为74.37%。

2.4 HA陶瓷甲状软骨支架在动物体内的模拟实验结果

术后对动物的定期观察中，比较两组实验动物组。B组动物在饮食和发声方面明显优于A组动物。A组标本显微镜下显示其软骨缺陷处出现组织塌陷现象，导致A组动物发声困难，且饮食量明显减少。在生物学显微镜下观测B组软骨支架区域标本，追踪发现，镜下可见明显的材料填充区域，填充材料周围可见纤维增生伴玻璃样变，附近有新生软骨区域，部分切片可见吞噬材料后的多核细胞。后期标本显示在填充材料区域内可见明显的纤维细胞。新生的软骨依托HA陶瓷复合骨架生长，并与陶瓷复合材料融合，陶瓷材料复合骨架内出现成熟的纤维细胞。

3 结论

曲通TritionX－114能够有效地稳定浆料气泡，由此可通过机械搅拌法最后制备出平均孔隙率高达74.37%的HA泡沫陶瓷坯体。

由机械搅拌法而制备出的泡沫陶瓷其孔隙尺寸无法精确控制，其气泡孔隙的影响因素还有待进一步探讨。经测定，本次实验所用的800W搅拌器气泡所得孔隙大小聚集在150～300 μm之间，能满足骨架提供组织液循环的孔隙需求。

控制合适的浆料配比是制备HA泡沫陶瓷甲状腺软骨支架的一个关键技术。必须确保泡沫浆料在气泡发生破裂之前及充模完全之后完成凝胶固化的反应，从而才能得到需要的孔隙效果和甲状软骨支架模型。实验结果证明，本研究的泡沫浆料配比妥当。

所制备得到的HA陶瓷甲状软骨支架的生物力学强度为(2.3±0.2)mPa，可以满足甲状软骨缺损移植要求的强度承受能力。

由人工复合骨架植入实验动物组可以看到明显的新生骨的生长并试图吞噬陶瓷材料。在新生骨与陶瓷材料的吞噬和取代的交互过程中，骨架内生成了成熟的纤维细胞，动物的软骨缺损逐步得到修复。动物能正常饮食和发声，进一步见证了HA陶瓷复合甲状软骨支架在动物体内的实际应用可行性，为其在人体上的应用提供借鉴。

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