双色荧光原位杂交法检测乳腺癌及临床应用评价

潘小平 洪晓绿

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有120万妇女罹患乳腺癌，其中约50万妇女死于该疾病，其发病率还以每年2%的速度递增［1］。在我国占全身恶性肿瘤的7% ～10%，仅次于宫颈癌［2］。HER－2基因位于17号染色体，编码生长因子受体，在20% ～30%的乳腺癌中高度表达［3］，并且该基因的表达与乳腺癌的发生、发展及预后关系密切［4］，因此，检测HER－2表达的情况不仅有助于评估患者预后，也有助于治疗方案的选择。目前，HER－2的检测常采用免疫组织化学(IHC)法，但该方法只能检测蛋白的含量，且影响因素较多，尤其是早期的乳腺癌中该蛋白含量较低，检出率也较低。本研究采用不同的荧光素标记17号染色体的着丝粒和HER－2基因，建立全细胞荧光原位杂交(FISH)法，从分子基因水平检测HER－2基因的表达，并评价该方法的临床使用价值。

1 材料和方法

1.1 标本来源

选取2009年4月1日～2013年5月20日在我院接受乳腺手术且经病理学证实为乳腺癌患者的乳腺组织160例，所有患者均被告知参与本项研究且得到患者同意。乳腺癌的分类参照WHO2003标准，标本的来源及构成见表1，乳腺癌分期采用TNM分期(T:肿瘤大小，T0:原位癌;T1:肿瘤长径≤2 cm;T2:2 cm＜癌瘤长径≤5 cm;T3:＞5 cm;T4:不论肿瘤大小直接侵犯胸壁;N0:无区域淋巴结转移;N1～3:有区域淋巴结转移;Nx:区域淋巴结无法评估;G1:高分化;G2:中度分化;G3:低分化;Gx:不能判断分化程度。)

表1 标本的来源及分类

1.2 试剂及仪器

荧光原位杂交成像分析系统，杂交仪，荧光探针，缓冲液(2×SSC，pH 7.0±0.2)，变性液(70%(v/v)甲酰胺/2×SSC，pH7.0～8.0)，乙醇，固定液(甲醇:冰乙酸体积比3∶1)，胃蛋白酶K工作液(0.08 mg/ml)等。

1.3 试验方法

参照Jansen［5］等研究的方法在本实验室条件下作如下改良:将4 μm厚的福尔马林固定石蜡包埋切片根据标准的预处理程序进行处理［6］，切片经二甲苯脱蜡后依次浸入100%、80%、70%酒精各10 min脱水，50℃下用30%［W/V］酸性亚硫酸钠(sodium bisulfite)处理组织切片20～30 min，2×SSC溶液中漂洗5 min，将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液(0.2 mg/ml)中，37℃孵育20～30 min，将玻片置于73～78℃的变性液中浸泡5 min后依次置于70%、80%和100%乙醇中梯度脱水，置于45～50℃烤片机上预热3～5 min后与探针杂交，将10 μl探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片封片，置于湿盒中。42℃保温箱杂交过夜后，滴加15 μl DAPI复染剂，暗处放置10～20 min后，荧光显微镜下观察结果。

1.4 结果判断

首先在HE染色切片上确认癌细胞区域，然后在10×物镜下，FISH标本上找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构，仔细观察信号;在40×物镜下扫描整张切片，观察是否存在HER－2表达的异质性，以及标本的质量，满意的标本应是75%以上癌细胞核中都有杂交信号，在100×物镜下观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和比值计算。随机计数30个细胞，统计Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。当Ratio值＜1.8，显示无HER－2基因扩增;为阴性标本，当Ratio值＞2.2，显示HER－2基因扩增;为阳性标本，当Ratio值介于1.8～2.2之间时，可增加计数30个细胞或重新做FISH实验来判断最终结果。单个细胞17号染色体着丝粒探针绿色信号大于2，即为17号染色体多体。

1.5 统计学分析

直接统计FISH阴阳性个数，FISH阳性检出率各组间的差异采用卡方检验，当n＜40时，采用Fisher精确概率法，p＜0.05时有统计学意义，所有数据及其结果均在SPSS for windows 13.0上进行。

2 结果

2.1 方法学建立结果

本研究较为成功地建立了荧光原位杂交法，且阴阳性结果均能达到试剂盒要求，即在荧光显微镜下均能见到各自特异性荧光颜色。图1为乳腺癌阴性结果，在荧光显微镜下可见两个17号染色体探针信号(绿色)以及两个HER－2基因探针信号(红色);图2为FISH检测乳腺异常结果，在荧光显微镜下计数30个细胞，其中红色信号200个，绿色信号80个，Ratio值为2.5，即显示HER－2基因扩增;判断为阳性标本。且在同一个细胞中有三个绿色信号(黄色箭头所示)，即该标本还有17号染色体多体存在。

2.2 临床标本检测结果

用建立好的FISH法检测了160例乳腺癌石蜡标本，检出结果见表2，从表中可以看出，FISH总的阳性检出率为38.8%(62/160)，随着肿瘤增大，FISH阳性检出率越高，伴随淋巴结转移数目越多，阳性检出率也越高，病理级别越高，其阳性检出率也越高，但阳性检出率在上述三组间并不存在统计学意义，见表3，但在组织类型组别，FISH阳性检出率存在显著性差异(χ2=14.6，＜0.01)，见表3。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其检测方法各式各样，如高频超声、彩色多普勒显像［7］，以及血氧功能检测［8］等，但这些检测方法的敏感性和特异性偏低，不能给临床诊断与治疗提供准确的依据。在肿瘤的发生发展过程中，基因的改变早于形态的变化，因此，分子诊断技术在乳腺癌的诊断与治疗过程中显得尤为突出。HER－2基因与乳腺癌的发生、发展及预后关系密切［4］，因此，准确检测HER－2的表达情况对于乳腺癌患者的风险评估及预后有着重要意义［9］，也可指导是否采用赫赛汀单抗进行治疗［10］。目前，HER－2基因的检测主要包括PCR和IHC，PCR法检测时污染严重，假阳性率高，IHC法，因其操作简单价格廉价已广为病理科应用，但该检测方法影响因素较多，如在标本固定和处理过程中容易破坏HER－2蛋白，实用抗体的批号之间存在差异等，这些均使得IHC结果准确率降低。而FISH法是一种基于细胞遗传学的检测技术，利用荧光素标记的探针对HER－2基因和17号染色体，直接和乳腺癌细胞进行杂交，稳定性好，大大增强了检测的特异性［11］。

表2 FISH阳性检出率

表3 各变量之间的比较

在160例乳腺组织中，FISH总体的阳性检出率为38.8%(140/160)，与有关报道的阳性检出率相差不大［12］。肿瘤越大，阳性检出率越高，淋巴结转移数量越多，阳性检出率也越高，同样，病理级别越高，阳性检出率也越高，但在上述三组间FISH阳性检出率并无显著性差异，p值在各组间均＞0.05(比较结果见表3)，而在组织类型组织的比较中，FISH阳性检出率之间却存在显著性差异(χ2=14.6，＜0.01)，说明FISH在检测HER－2基因扩增时与乳腺肿瘤的瘤体大小、病理级别以及淋巴结转移的数目并无相关，而只与乳腺癌的组织类型有关，说明HER－2基因在导管型的癌体中表达较高。

因此，FISH法能特异敏感地检测出乳腺癌中HER－2基因的表达，检测结果稳定，不影响HER－2蛋白的表达，检测的准确率高，能有效的指导临床用药，及时对乳腺癌患者进行风险评估，且该法操作简单，结果快速，宜在临床科室开展。

［1］PARKIN DM，BRAY F，FERLAY J，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2005，55:74 －108.

［2］吴在德，吴肇汉，郑 树，等.外科学［M］.北京:人民卫生出版社，2003:327 －328.

［3］ECCLES S A.The role of c－erB－2/HER－2/neu in breast cancer progression and metataise［J］.J Mammary Gland Biol Neoplsaia，2001，6:393 －406.

［4］NABHOLTZ JM，Slamon D.New adjuvant strategies for breast cancer:meeting the challenge of integrating chemotherapy and trastuzumab(Herceptin)［J］.Semin Oncol，2001，3:1 －12.

［5］JANSEN G J，MOOIBROEK M，IDEAM J，et al.Rapid identification of bacteria in blood cultures by fluorescently labeled oligonucleotide probes［J］.J Clin Microbiol，2000，38:814 －817.

［6］LEBEAU A，DEIMLING D，KALTZ C，et al.HER －2/neu analysis in archival tissue samples of human breast cancer:comparision of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization.［J］.Clin Oncol，2001，19:354 － 363.

［7］郑梅芳.高频超声及彩色多普勒显像在乳腺肿块诊断中的应用［J］.现代医院，2010，10(3):74－75.

［8］孙立宏，张方璟，彭向莉，等.乳腺血氧功能检查在乳腺体检筛查中的应用［J］.现代医院，2012，12(12):46－47.

［9］ROMOND E H，PEREZ E A，BRYANT J，et al.Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER－2 positive breast cancer［J］.N Engl J Med，2005，353:1673 －1684.

［10］DOLAN M，SNOVER D.Comparison of immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization assessment of HER－2 status in routine practice［J］.J Am J Clin Pathol，2005，123:766 －770.

［11］白燕峰，任国平，王 波，等.双探针显色和荧光原位杂交法检测乳腺癌HER－2基因状态和17号染色体的分析［J］.中华病理学杂志，2010，39(3):161 －165.

［12］韩晓红，石远凯，马 丽，等.应用FISH和IHC技术检测中国乳腺癌患者HER－2基因状态及蛋白表达的前瞻性多中心研究［J］.中华检验医学杂志，2010，7(33):655 －662.