基于IFA技术检测微线体蛋白2在艾美耳属球虫的空间分布*

田秀玲 汤新明 秦 梅 索静霞 刘贤勇 索 勋

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

艾美耳属球虫是一类广泛寄生于多种宿主动物消化系统的顶复门原虫。艾美耳属球虫生活史复杂，包括在宿主体内的无性生殖(裂殖生殖)和有性生殖(配子生殖)两个阶段(索勋等, 1998)。无论是裂殖生殖还是配子生殖时，都需要子孢子或裂殖子分泌棒状体蛋白和微线体蛋白来协助入侵(Dubremetzetal., 1998)。其中，微线体蛋白2是柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞时分泌的主要蛋白之一，亦是构成微线体细胞器的结构蛋白(Tomleyetal., 1996)。但是，现有文献资料并不能清晰的阐明球虫微线体蛋白2与宿主细胞相互作用的机制。主要因为目前所运用的静态观察(如电镜)的办法还难以记录分泌、侵入等动态过程(索勋等, 1998)。以上所述是基于鸡球虫的研究，关于其他物种的艾美耳属球虫微线体蛋白2的研究只有极少的相关报道和文献资料(Watanabeetal., 2001)。

间接免疫荧光实验(Indirect Immunofluorescence Assay, IFA)技术是基于免疫学、生物化学和显微镜技术等学科的发展建立的一种检测技术。由于其特异性强、敏感性高、速度快、可视效果佳等优点广泛应用于免疫学、细胞生物学等生命科学研究领域(Sardyetal., 2013)。间接免疫荧光染色技术亦是原生动物生物学、免疫学等研究最为常见的技术之一，如研究疟原虫、弓形虫及艾美耳属球虫蛋白的空间定位、寄生虫与宿主细胞的蛋白互作、免疫及其他信号通路等(Tschanetal., 2010; Huangetal., 2011; Sunetal., 2012)。

本实验室构建了一株柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2(EtMic2)单克隆抗体，在前期研究中，以该株单克隆抗体检测柔嫩艾美耳球虫表达分泌型外源蛋白的空间定位，发现该株单克隆抗体应用于间接免疫荧光染色技术检测效果良好(Huangetal., 2011)。鉴于其他物种艾美耳属球虫微线体蛋白2研究的匮乏，本研究利用柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2(EtMic2)单克隆抗体为检测抗体，利用间接免疫荧光染色技术检测微线体蛋白2在其他艾美耳属球虫的空间分布，初步确定微线体蛋白2在艾美耳属球虫空间分布的共性与特性，为微线体蛋白2的后续研究及研究艾美耳属球虫相关蛋白的分布奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与虫株

柔嫩艾美耳球虫Eimeriatenella北京株，和缓艾美耳球虫E.mitis涿州株，斯氏艾美耳球虫E.stiedai张家口株，无残艾美耳球虫E.irresidua张家口株均由本实验室分离保存。

1日龄AA肉鸡购自北京华都肉鸡有限公司，饲养于无球虫污染的禽用隔离器(IPQ-3型，苏州市苏杭实验动物设备厂)中，自由采食、饮水。

实验用新西兰大白兔由本实验室涿州实验基地提供。

1.2 卵囊富集

E.tenella与E.mitis卵囊的富集使用4只2～3周龄AA肉鸡(体重约0.5 kg，雌雄各半)，E.stiedai与E.irresidua卵囊的富集使用2只6周龄新西兰大白兔(体重约为1 000 g，雌雄各半)。口服接种适量卵囊后，饱和盐水漂浮法收集排卵囊期粪便中的卵囊(肝脏中的E.stiedai卵囊用胰酶消化法收集)，重悬于2.5%的重铬酸钾溶液中，26℃，48 h孢子化后，4℃保存，备用。

1.3 子孢子提取

本研究用子孢子的提取依据参考文献(Liuetal., 2008)。取1×107纯化后的孢子化卵囊，冰浴研磨，镜检至80%以上卵囊破碎释放出孢子囊。用脱囊消化液(10%胆汁+ 90 % PBS + 0.75%胰酶)42℃消化30 min左右，至90%以上子孢子从孢子囊释放，洗去脱囊消化液，加入预先平衡好的DE-52纤维素层析柱中进行子孢子的纯化，洗脱液为甘氨酸缓冲液(pH=8.0)，以恒流泵控制流速为1～2滴/s，每2 min镜检流出液体中子孢子含量及纯度，待视野中子孢子量极少或出现孢子囊时，停止过柱，纯化完毕(整个纯化过程维持环境温度在42℃左右)。纯化后血球计数板计数，计数后子孢子浓度稀释至每100 μL含有106个子孢子，备用。

1.4 间接免疫荧光实验(IFA)

IFA操作步骤依据参考文献(Huangetal., 2011)。载玻片以多聚赖氨酸预处理，滴加100 μL子孢子悬液，待其自然沉降后，-20℃甲醇固定10 min；穿膜缓冲液(Triton X-100)室温孵育5 min；1% BSA封闭30 min；EtMic2单抗(本实验室制备)稀释后(确定最佳稀释度时作1∶100、1∶200、1∶500、1∶800和1∶1 000五个稀释度，后续实验采用1∶100稀释)室温孵育1 h，同时以无关抗体(鼠抗黄色荧光蛋白，本实验室制备)作为对照；Cy3标记的羊抗鼠IgG(Proteintech Group, Inc)1∶100稀释室温孵育1 h(上述各操作均需PBS(pH=7.4)洗涤5次)；滴加抗荧光衰减剂后封片，4℃避光保存，待镜检。镜检时，使用激光共聚焦显微镜(莱卡，Leica TCSSP5Ⅱ)观察，并保存图像。

1.5 图像处理

本实验所有图像均采用LAS AF Lite(莱卡，Leica)软件进行处理。

2 结果

2.1 EtMic2单克隆抗体可应用于间接免疫荧光实验(IFA)

利用单克隆抗体制备技术，我们获得了若干株抗EtMic2的单克隆抗体，并对其进行鉴定，发现其中一株(2A52D61G8)应用于IFA可特异性的与柔嫩艾美耳球虫子孢子Mic 2蛋白特异性结合(图1-1)。说明该株单克隆抗体能够特异性识别Mic 2的抗原表位，应用于间接免疫荧光实验。

抗体稀释浓度是影响IFA结果的关键因素之一，本实验所用荧光标记的二抗为商品化试剂，选择推荐使用浓度(1∶100)，为保证实验的特异性与敏感性，我们分别以1∶100、1∶200、1∶500、1∶800和1∶1 000五个一抗(EtMic2单抗)浓度梯度进行比较，以确定后续实验所用抗体的最佳稀释浓度。结果显示，一抗稀释比例为1∶100时所有虫体(柔嫩艾美耳球虫子孢子)能够在微线体部位检测出特异性荧光(图1)，并且没有非特异背景着色；稀释比例为1∶1 000时所有虫体均检测不到特异性荧光；其余3个稀释比例下，亦有部分虫体不能着色(结果未显示)，因此，后续实验一抗稀释比均选择1∶100。

图1 EtMic2定位于柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫、无残艾美耳球虫子孢子顶部Fig. 1 Mic 2 protein was located in the anterior region of E. tenella, E. mitis, E. stiedai, E. irresidua sporozoitesA：以EtMic 2单抗为一抗，Cy3标记的羊抗鼠IgG为二抗；B: 以无关抗体为一抗，Cy3标记的羊抗鼠IgG为二抗。Cy3：红色荧光通道采集的图像；Bright：白光通道采集的图像；Merge：上述两图像的组合。1. 柔嫩艾美耳球虫; 2. 和缓艾美耳球虫; 3. 斯氏艾美耳球虫; 4. 无残艾美耳球虫。标尺=5 μm。A: The primary antibody was EtMic 2 monoclonal antibody and the secondary antibody was Cy3-Goat-anti-Mouse IgG; B: The primary antibody was a negative antibody and the secondary antibody was Cy3-Goat-anti-Mouse IgG. Cy3: Image was captured from RFP light laser; Bright: Image was captured from white light laser; Merge: Image obtained from the above two images. 1. E. tenella；2. E. mitis；3. E. stiedai；4. E. irresidua. Bar=5 μm.

2.2 EtMic 2蛋白在艾美耳属球虫子孢子的空间分布

柔嫩艾美耳球虫E.tenella作为鸡球虫研究的模式虫种，某些蛋白(如Mic2)的空间定位、与宿主细胞互作等均有报道(Dingetal., 2005)，本研究拟确定针对EtMic2的单克隆抗体能否识别其他艾美耳属球虫的微线体蛋白2，初步确定Mic 2的空间分布。结果显示，无论是寄生于鸡其他种的艾美耳属球虫如和缓艾美耳球虫E.mitis还是寄生于兔的艾美耳属球虫如斯氏艾美耳球虫E.stiedai与无残艾美耳球虫E.irresidua，对上述虫种以EtMic2单克隆抗体进行IFA染色后，在和缓艾美耳球虫(图1-2)、斯氏艾美耳球虫(图1-3)和无残艾美耳球虫(图1-4)子孢子顶部均检测到特异性荧光，只是兔球虫与鸡球虫相比，荧光强度较弱(图1)。

3 讨论

本研究以一株EtMic2单克隆抗体为检测抗体检测Mic 2蛋白在艾美耳属球虫的空间分布，研究结果显示，无论是鸡球虫还是其他物种球虫虫种的Mic 2蛋白均可以被EtMic2单抗识别，特异性荧光均出现在子孢子顶部且着色形式没有差异。研究结果初步说明，Mic 2蛋白在不同种艾美耳属球虫相对保守，亦或是EtMic2单抗针对的抗原表位位于Mic 2蛋白保守区域；荧光强度略有差异，反映出Mic 2蛋白在不同种球虫中表达量存在差异。

艾美耳属球虫是一个大家族，已命名的大约有1 040种(索勋等, 1998)，本研究只是选取了寄生于鸡和兔的4种艾美耳属球虫，只能部分反应Mic 2蛋白在艾美耳属球虫的空间分布，寻找其空间分布的共性尚需进行大量样本的检测。但是，鸡球虫、兔球虫的虫种差异很大(Long, 1982)，它们的Mic 2蛋白均可被EtMic2单抗所识别，亦能部分说明Mic 2蛋白在艾美耳属球虫中的保守性，因此，关于EtMic2蛋白功能的研究也可为研究其他艾美耳属球虫提供借鉴。

蛋白的空间分布形式往往决定了其激发宿主免疫应答的类型，如转基因球虫靶向不同部位的模式抗原(黄色荧光蛋白，EYFP)激发宿主不同类型的免疫应答，靶向球虫微线体部位(分泌型蛋白)的EYFP偏向激发宿主Th 2型免疫应答；而定位于柔嫩艾美耳球虫子孢子细胞核(非分泌型蛋白)的模式抗原偏向激发宿主Th 1型免疫应答(Huangetal., 2011)。提示我们，研究球虫不同组分激发宿主免疫应答的类型可以首先判断其空间分布形式，是分泌型蛋白(如与Mic 2共定位)还是非分泌型蛋白，进而为后续研究该组分激发宿主的免疫应答的类型奠定基础，进一步解析球虫激发宿主免疫应答的机理。