肠艾美耳球虫张家口分离株致病性和免疫原性的初步研究*

李 超 汪运舟 陶鸽如 王 丹 焦雅清 顾小龙 索 勋 刘贤勇

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

兔球虫病是家兔感染一种或数种艾美耳属兔球虫后引起的一类寄生性原虫病，感染率高，幼兔感染率高达90%以上(崔平等，2010)，危害大，尤其对断奶至3月龄仔兔影响严重，主要引起腹泻、消瘦、生长缓慢等症状，严重时可导致死亡，每年给养兔业带来重大损失(Sherkovetal., 1986)。

目前世界公认的兔球虫有11个种，主要致病虫种为：肠艾美耳球虫Eimeriaintestinalis、黄艾美耳球虫E.flavescens、大型艾美耳球虫E.magna和斯氏艾美耳球虫E.stiedai(Pakandl, 2009)。我国的两次兔球虫病流行病学调查指出，家兔的肠艾美耳球虫平均感染率分别为21.25%(张龙现等, 1999)和14.8% (Jingetal., 2012)，属于较高水平。已有研究表明，肠艾美耳球虫属于高致病性虫种， 5×103个卵囊感染即可使仔兔发病，导致半数死亡(Coudertetal., 1993)；有报道，人工感染家兔1×105个以上卵囊可导致其出现严重临床症状(殷佩云等，1990)；而Shi等(2014)的研究则表明，接种5×103浙江株卵囊未见明显的临床症状，且免疫原性也弱于之前的报道。

鉴于这种地方分离株在生物学特性上的差异，我们对肠艾美耳球虫张家口分离株的致病性和免疫原性进行了研究，可为今后的兔球虫病疫苗的开发提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 卵囊

我们从张家口一兔场利用单卵囊分离技术，获得了纯种肠艾美耳球虫，收集9～12 d的卵囊并使其孢子化(在摇床上，卵囊悬于2.5%重铬酸钾溶液中，转速为100 r/min，与空气充分接触，26 ℃，60 h)。在显微镜下观察其形态，包括形状、有无卵膜孔、有无内外残体，并测量大小(n=100)。将1 000个该株孢子化卵囊口服接种无球虫兔，获得大量卵囊，用于致病性和免疫原性实验。

1.2 实验动物

35～45日龄无球虫新西兰大白兔(雌雄各半，体重800～1 000 g)，均来自中国农业大学涿州实验基地无球虫兔繁育场。实验兔均饲养于清洁、通风、照明充足的无球虫兔舍，并且在实验前经粪便检查确保无球虫感染。实验兔均单笼饲养，可自由采食饮水。

1.3 实验设计

20只无球虫兔随机分为5组，每组4只。第1组为空白对照组，实验全程不接种球虫，并饲喂添加抗球虫药物的饲料(莫能菌素20 mg/kg和地克珠利1 mg/kg；第2、3、4组为攻虫组，每只分别口服接种肠艾美耳球虫孢子化卵囊1×104、1×105、1×106个；第5组为攻毒对照组，不接种球虫。接种后， 0、7、14和21 d称重；7 d开始，每天观察家兔临床症状，7 d清粪，10、14和21 d采集粪样，并称量粪便总重，以进行卵囊检测。21 d后，第2、3、4、5组分别接种1×106个肠艾美耳球虫进行攻毒，并持续观察21 d，每天记录临床症状，攻毒后0、7、14和21 d进行体重称量和粪便采集。每次采集粪样后，用麦克马氏法进行卵囊计数(索勋等，1998)。

1.4 数据处理

所有数据用SPSS17.0软件进行统计学处理分析。

2 结果

2.1 肠艾美耳球虫张家口分离株的鉴定

在40倍显微镜下进行形态学鉴定，卵囊均呈梨形，尖端有明显的卵膜孔，卵囊内有4个孢子囊和1个外残体，每个孢子囊内有2个子孢子和1个内残体，每个子孢子内有1个折光体；卵囊长宽大小均在(27.0～32.0)μm×(17.0～20.0)μm范围内(n=100)，与文献描述吻合(Eckertetal.，1995)，表明所分离的是纯种肠艾美耳球虫，命名为肠艾美耳球虫张家口分离株(图1)。

图1 肠艾美耳球虫张家口分离株孢子化卵囊 (标尺长度为20 μm)Fig. 1 Sporulated oocysts of Eimeria intestinalis, ZJK isolate (bar=20 μm)

2.2 肠艾美耳球虫张家口分离株致病性测定

2.2.1 临床症状：第2、3、4组实验兔接种后第8 d开始，均出现不同程度的精神沉郁、厌食等症状；9 d后第3、4组所有实验兔和第2组两只实验兔出现腹泻；14 d后，第3组死亡1只，第4组死亡2只。死后剖检均发现肠壁增厚，肠道有明显出血，确定为球虫感染所致。接种后14～21 d，耐受个体临床症状逐渐消失，食欲、精神状况逐渐恢复。

2.2.2 体重变化：实验期间，空白对照组平均日增重始终保持稳定，达到31～39 g；接种后7 d即肠艾美耳球虫潜隐期内，除第4组体重略有降低外，其余各组体重增长水平与空白对照组无差异；接种后7～14 d，第2、3、4组平均日增重均有大幅下降，且第3、4组更为明显；接种后14～21 d，第4组体重下降幅度明显降低；第3组体重开始增长，而第2组则表现体重的迅速代偿，日增重超过空白对照组(表1)。由此可见，肠艾美耳球虫张家口分离株能够使家兔致

表 1 初次接种后平均日增重的变化Tab. 1 Mean daily weight gain after first inoculation

使用one-way ANOVA法进行多组间差异性分析，平均值(平均值±标准差)上标字母表示差异性显著(P<0.05,n=4)； dpi：接种后天数。下同。

One-way ANOVA test for significant difference test，means (M±S.D.)with different superscript are significant different；dpi: days post inoculation. The same below.

病：接种1×104个卵囊即可导致明显的体重下降，影响生产性能；超过1×105个卵囊的感染可能导致家兔死亡。

2.2.3 卵囊排出量：初次接种后8 d开始，第2、3、4组家兔均排出大量卵囊，接种后11～14 d达到高峰，18 d之后逐减少。随着接种剂量的增加，卵囊排出量也增加。其中第4组家兔卵囊排出总量最大，高峰时期(接种后11～14 d)，平均每只兔可排出卵囊5×108以上(表2)。

表2 初次接种后各组兔平均排卵囊量Tab. 2 Oocyst output per rabbit after first inoculation

2.3 肠艾美耳球虫张家口分离株免疫原性测定

为验证肠艾美耳球虫张家口分离株的免疫原性，我们对第2、3、4组实验兔再次接种1×106个卵囊，第5组作为攻毒对照组，同样接种1×106个卵囊。监测实验兔临床病变、日增重变化、卵囊排出量。

2.3.1 临床症状：攻毒后，免疫组(第2、3、4组)均未出现临床症状；而攻毒对照组(第5组)则在第7 d开始出现精神沉郁、腹泻、厌食等症状，且生长严重停滞，18 d后逐渐恢复。空白对照组(第1组)生长良好。

2.3.2 体重变化：攻毒后，免疫组实验兔日增重均未受到影响，表明机体已建立了有效的免疫保护(表3)。其中，第3、4组与空白对照组(第1组)相比无显著差异，而第2组日增重水平则高于第1组，出现了一定程度的生长代偿。攻毒对照组的体重则出现了明显降低。

2.3.3 卵囊排出量：攻毒后，免疫组的卵囊排出量均为1×106左右，较攻毒对照组显著减少，减少率均在99%以上；同时也远低于第一次接种后卵囊排出量，攻毒对照组家兔则排出超过1×108个卵囊(表4)。

3 讨论

本文对肠艾美耳球虫张家口分离株的致病性及免疫原性进行了初步研究。结果表明，感染1×104个肠艾美耳球虫孢子化卵囊可引起明显临床症状，体增重受到抑制，更高剂量的感染则会导致家兔死亡；同时肠艾美耳球虫具有良好的免疫原性，初次感染可激发良好的保护性免疫应答，从而抵抗再次感染。

表3 攻毒后各组兔平均日增重的变化Tab. 3 Mean daily weight gain after challenge

临床症状、体重变化以及死亡率是衡量兔球虫致病性的主要标准。之前的研究表明肠艾美耳球虫致病力较强，半数致死量为5×103个卵囊(Coudertetal., 1993)；有研究也表明肠艾美耳球虫感染后能够引发严重的临床症状，家兔生产性能受到极大抑制(Shietal., 2014)。

表4 攻毒后后各组兔平均排卵囊量Tab. 4 Oocyst output per rabbit after challenge

本研究中，张家口分离株致病性稍弱，1×105才能引起个别家兔死亡，但是引起的临床病变和体重降低同样十分明显，表明了该分离株对生产有着一定的危害，致病性为中等。实验中还发现，1×104个卵囊感染后第3周，实验兔日增重水平可快速恢复，表明非致死剂量感染后，家兔能够较为明显的代偿，这就提示将来活卵囊疫苗应用可能会得到相同的效果，为今后的疫苗研究提供了保证。

肠艾美耳球虫具有优秀的免疫原性，6个卵囊的免疫就足以减轻攻毒后的临床表现，而6×102或更多的卵囊，则可提供完全保护(Coudertetal., 1993)；肠艾美耳球虫浙江株的初次感染能够为动物提供足够的免疫保护(Shietal., 2014)。本实验中，攻毒后免疫组均未表现出临床症状，卵囊排出减少90%以上，表明该株与前人报道相似，同样具有良好的免疫原性，再次证明了肠艾美耳球虫进行免疫手段预防的可行性。

活卵囊疫苗是球虫病疫苗开发的趋势，但免疫的同时可能会对家兔的健康和生产性能造成影响，因此利用弱毒虫株是解决该问题的最佳手段。目前国外已经成功地选育出肠艾美耳球虫早熟株，能够在保留良好免疫原性的同时降低其毒力(Licoisetal., 1990)。而国内尚无兔球虫早熟选育成功的报道，疫苗研究相对落后。本实验证实了肠艾美耳球虫张家口分离株具有较强的致病性良好的免疫原性，因此有进行早熟选育的必要，以使其成为未来兔球虫病疫苗的的组分之一。