表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫的构建*

秦 梅 汤新明 刘贤勇 陶鸽如 索静霞 田秀玲 索 勋

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

禽流感是禽类最为常见的传染病之一，对养殖业危害巨大。不仅高致病性禽流感病毒具有重大的公共卫生学意义，低致病性禽流感病毒同样可以给养禽业造成巨大损失，引起鸡产蛋率下降，甚至与其他病原体共感染导致鸡群的高死亡率(Biswasetal., 2008)，还对人类健康构成严重威胁，尤其是H9N2 禽流感病毒，不仅流行于全世界，而且还可以感染人(Buttetal., 2010; Chengetal., 2011)。现代化养殖业中，免疫预防是控制畜禽疫病流行最基本最有效的手段。尽管疫苗在禽流感等疫病的防控中发挥了重要作用，但目前仍存在不少问题，如不同品系的鸡需要经过多次肌肉注射疫苗免疫，这样会给鸡造成很大应激，致使生产性能严重下降，因此，迫切需求一种可以采用温和粘膜免疫途径的优秀疫苗。

鸡球虫是一种寄生于肠道的顶复门原虫，其生物安全性很高——感染为自限性且只有唯一宿主；球虫系一类真核生物，可以表达已糖基化修饰(具有更强的抗原活性，如HA蛋白的糖基化位点与其抗原性密切相关)的活性抗原蛋白(Lillehoj, 1994)；口服接种简单易行，省时省力等。研究证实球虫可以刺激宿主产生良好的粘膜免疫应答，产生的sIgA和循环抗体IgY在初免后一周内即可高水平表达，感染8～14 d后达到峰值，抗体水平可维持数月之久(Lillehojetal., 1987)。细胞免疫应答是宿主抵抗球虫感染的主要免疫机制。球虫感染鸡群后，CD8+T 细胞被招募至肠粘膜组织发挥细胞免疫应答(Lillehojetal., 2000)；若鸡球虫作为疫苗载体表达其他病原的保护性抗原，那么就可以激发宿主产生良好的细胞免疫应答和粘膜免疫应答。因此，转基因球虫活载体疫苗有望成为继致弱细菌和病毒载体疫苗之后更加理想的粘膜免疫疫苗。

自1993年转染技术首次在弓形虫中操作成功以来，顶复门原虫的转染研究得到了快速发展(Soldatietal., 1993)，鸡柔嫩艾美耳球虫Eimeriatenella已经实现瞬时转染和稳定转染(Haoetal., 2007; Yanetal., 2009)。和缓艾美耳球虫致病力弱(Tyzzer,1929; Joyner, 1958; Shirleyetal., 1983; 朱珊珊等，2007)、免疫原性强(汤新明等，未发表数据)，是作为疫苗活载体的又一良好选择。但是，稳定转染是发展转基因和缓艾美耳球虫作为疫苗载体的必要条件，因此，在本研究中，我们用和缓艾美耳球虫成功稳定表达H9N2禽流感病毒主要保护性抗原-血凝素HA1蛋白，为和缓艾美耳球虫作为H9N2禽流感病毒的疫苗活载体奠定了研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和虫株

1日龄AA肉鸡由北京华都肉鸡公司提供，运回实验室饲喂不含任何抗生素的全价料，于育雏隔离器内饲养。本研究采用和缓艾美耳球虫涿州株来源，由本实验室分离和保存。

1.2 和缓艾美耳球虫子孢子的提取

参照文献(Longetal.,1975; Huangetal., 2011; Yinetal., 2011)：取5×107个新鲜艾美耳球虫卵囊，3000 r/min离心5 min，收集沉淀。用灭菌的pH 7.6的PBS洗涤卵囊沉淀3次。将玻璃研磨器置于冰上研磨卵囊，至90%的卵囊破壁，孢子囊释出。利用孢子囊消化液稀释粗提的孢子囊沉淀至浓度为5.0×106个/mL。将稀释后的悬液于42 ℃水浴锅中孵育45 min至约90%的子孢子释出。停止消化后，将所得的悬液3 000 r/min离心3 min，弃去上清。并用PBS洗涤沉淀。收集子孢子的粗提物沉淀，再用甘氨酸洗脱液(0.75 g 甘氨酸，7.9 g NaCl溶于400 mL Mili-Q超纯水，用0.1 mol/L NaOH调节pH至 7.6～8.0，补水至500 mL，高压灭菌)将子孢子粗提物重悬，向DE-52纤维素层析柱上缓缓加入子孢子粗提悬液，打开恒流泵并开始用离心管收集子孢子。收集期间不断向柱中加甘氨酸洗脱液，同时用玻璃棒轻轻搅动纤维素表层。当镜检至每个视野中(10倍光镜下)子孢子减少至10个左右时，停止收集。将所得的子孢子悬液2000 r/min离心10 min，收集子孢子沉淀。

1.3 球虫载体的构建

本研究室已有的pMIC-EYFP/ACT-RFP 质粒(Yinetal.,2011)经AgeI和SacII、KpnI 和AvrII 酶切后得到的骨架连接禽流感病毒H9N2 HA1和TgDHFR-EYFP基因分别代替RFP 和EYFP基因，得到双框表达载体双框表达载体质粒Mic-DHFR-EYFP/ACT-chFcGPI-ACT (pMDEAAsschFcGPIA)。酶切鉴定后按照提取质粒试剂盒说明书大量提取质粒(北京艾德莱生物科技有限公司)，用SnaBI限制性内切酶过夜酶切线性化质粒，然后用饱和酚、氯仿抽提酶切产物，最后用灭菌蒸馏水溶解，使DNA浓度在2 μg/μL。

1.4 和缓艾美耳球虫体外瞬时转染和体内稳定转染

用100 μL核转缓冲液(内含有10 μg 线性化质粒，5 μLSnaBI 内切酶，再用核转缓冲液补充至100 μL)将提纯后的球虫子孢子悬起加入至电击杯中用核转仪U-033程序核转染后接种细胞或鸡只。对体外瞬时转染，1×106球虫子孢子核转染后接种MDBK 细胞，18 h后加含150 μg/g的乙胺嘧啶(Sigma-Aldrich Co., St.Louis, Mo., USA)细胞培养液，转染24 h后观察虫体发光情况；对体内转染，每只1日龄的AA肉鸡泄殖腔接种2×106核转染的球虫子孢子，接种18 h后，饲喂含150 μg/g的乙胺嘧啶饲料；接种后5～8 d收集卵囊，于孢子化后在荧光显微镜下观察发光情况，第1代发光卵囊经流式筛选后再次接种无球虫鸡进行第2代筛选，同时饲喂含150 μg/g的乙胺嘧啶饲料，直至发光率稳定即可，转基因球虫命名为Emi.HA1。

1.5 转基因和缓艾美耳球虫的鉴定

按照文献(Liuetal., 2013)提取球虫基因组和蛋白，分别进行PCR，染色体步移技术(Genome walking)，间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)鉴定。

1.5.1 转基因球虫PCR及插入位点鉴定: 扩增片段HA1和YFP的引物序列分别为HA1-F:5′A C C G G T A T G G A G C A G A A G C T G A T T A G C G A G G AG HA1-R:5′C C T A G G G C G A G A G C T G C G G C T G G G C A C G T TG3′;YFP-F: 5′A T G G T G A G C A A G G G C G A G GA3′;YFP-R: 5′A A G C T T C T T G T A C A G C T C GT3′;为检测外源基因表达框插入和缓艾美耳球虫基因组的位点，本研究采用染色体步移技术，操作程序按照试剂盒说明书(Takara, Dalian, China)进行。根据MIC2启动子序列设计特异性引物SP1(5′A A G G C G A G C G A A G C T G T T C A CT3′ )SP2(5′C C A T G C T T G G A G G A A A C T T T GC3′) SP3(5′G C C T C T C G A A G G A T C T G A A T GC3′)，4个随机引物AP1、AP2、AP3、AP4为试剂盒中提供。第3轮PCR扩增出的条带切胶回收后连接pEASY-T1-simple vector (TransGen Biotech)，对测序后的序列用DNAStar7.0软件进行分析，并用E.mitisDB database对插入的位点进行序列比对(Kimetal., 2004)。

1.5.2 和缓艾美耳球虫表达流感病毒HA1蛋白鉴定：用提取的转基因球虫全蛋白进行SDS-PAGE，原核表达的HA1蛋白作为阳性对照，野生球虫蛋白作为阴性对照，然后转PVDF膜，鼠源HA1蛋白多抗作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，然后化学发光显色。

1.5.3 转基因球虫表达的外源蛋白HA1在子孢子中的定位：经DE-52纤维素层析柱纯化后子孢子用预冷的丙酮固定在多聚赖氨酸处理过的载玻片上-20 ℃ 20 min，PBS洗3遍后用0.1% X-100 穿膜15 min，随后用1% BSA 封闭60 min，鼠源HA1蛋白多抗作为一抗孵育1 h，PBS洗4遍后用Cy3标记的羊抗鼠IgG作为二抗孵育1 h，PBS洗4遍后封片。在激光共聚焦显微镜(SP5, Leica, Germany)下观察蛋白定位情况。

1.6 转基因球虫与野生球虫繁殖力比较

8只1周龄的AA肉鸡随机分为两组，分别感染1 000个表达H9N2禽流感病毒HA1的转基因球虫和野生球虫，于感染后5～11 d间隔24 h 后取粪便样品用麦克马良计数板进行卵囊计数，最后绘制转基因球虫和野生球虫感染后5～11 d的排卵囊曲线。

2 结果

2.1 转基因和缓艾美耳球虫双框表达载体的构建

将禽流感病毒H9N2的HA1基因片段从实验室已有载体中酶切胶回收后连接入球虫骨架载体(本研究室已构建好的载体)得到最终载体pMic-DHFR-EYFP-Actin/Actin-HA1-Actin(图1-A)，经酶切鉴定，质粒构建完全正确(图1-B)。

图1 表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白转基因和缓艾美耳球虫载体的构建Fig.1 Construction of vector expressing HA1 region of H9N2 influenza virusA. 转染用载体pMic-DHFR-EYFP-Actin/Actin-HA1-Actin转基因球虫载体图。ss：弓形虫致密颗粒8信号肽。B.双框表达载体的鉴定。a. AgeI和SacII的酶切鉴定。1：未酶切的质粒；2：AgeI和SacII酶切后的质粒。b. 转染用的线性化质粒酶切鉴定图。1：未酶切的质粒；2：SnaBI酶切后的线性化质粒。M: D2000 plus marker。A. Expression cassettes are shown as colored boxes. The EYFP coding region is flanked by the MIC2 promoter and 3′region of actin derived from E. tenella; while the foreign protein region is flanked by the promoter of actin (Act), 3′region of actin and signal sequence(ss, 84 bp) derived from dense granule protein 8 (GRA8) of T. gondii. B. Identification of double cassettes. a. Digestion identification. 1: Undigested plasmid; 2: Digested plasmid with AgeI and SacII. b. Linearized plasmid for transfection.1: Undigested plasmid; 2: Digested plasmid with SnaBI. M：D2000plus marker.

2.2 转基因和缓艾美耳球虫的体外瞬时和体内稳定转染

由图中可以看出，子孢子接种24 h，转染质粒的子孢子表达黄色荧光蛋白(图2-A)。转染后的子孢子泄殖腔接种肉鸡后，收集接种后5～8 d的卵囊，孢子化后在荧光显微镜下可观察到发光卵囊，然后在鸡体内连续传代，第1代的发光率为0.2%，第3代时发光率达到60%(图2-B)，之后又连续两代传代，发光率稳定在90%，未孢子化卵囊是不发荧光的，这与质粒元件Mic启动子有关，Mic是一个阶段性表达蛋白，在未孢子化阶段不表达黄色荧光蛋白。与本研究室只用流式筛选相比(Huangetal., 2011; Yinetal., 2011)，药筛和流式双筛选的方法大大提高了转基因球虫的筛选效率，为更快获得稳定转基因球虫进行后续球虫生物学和免疫学等研究奠定基础。

图2 转基因和缓艾美耳球虫体外瞬时和体内稳定转染Fig.2 Transfection with pMic-DHFR-EYFP-Actin/Actin-HA1-Actin in vitro and in vivoA：质粒pMic-DHFR-EYFP-Actin/Actin-HA1-Actin转染子孢子后接种MDBK细胞；B：转基因和缓艾美耳球虫第3代的荧光图；C：用confocal 显微镜拍摄的发光卵囊。Bar=10 μm。A. Sporozoites transfected with the plasmid in a MDBK cell; B. Fluorescence Emi. HA1 oocysts at the third passage; C. Fluorescent Emi.HA1 oocysts was observed by confocal microscope.

2.3 转基因和缓艾美耳球虫基因水平和蛋白水平鉴定

用第4代的发光Emi. HA1卵囊提取基因组，分别用HA1和YFP特异性引物PCR扩增，得到预期片段大小的条带(图3-A，HA1,1 000 bp, YFP, 750 bp)；为确定质粒插入和缓艾美耳球虫基因组的位点，本研究利用染色体步移技术对插入位点进行了鉴定，图3-B为每条随机引物的3轮PCR图，对阳性克隆进行测序，检测到一个插入位点(Emh_4754)(图3-C)，由于此位点序列还没有被注释，因此我们暂时无法确定质粒整合的具体位置。Western blot 结果显示和缓艾美耳球虫成功表达了禽流感病毒H9N2的HA1 片段，由于原核表达载体中带有两个His 标签大小为12 kDa，因此蛋白要比球虫表达的大(图3-D)；间接免疫荧光结果显示HA1蛋白主要位于子孢子细胞膜和子孢子头部(图3-E)。

图3 转基因和缓艾美耳球虫基因表达外源蛋白的鉴定Fig.3 Validation of the stable transfected E. mitisA. PCR 鉴定。1: 阳性质粒; 2, 4: 转基因和缓艾美耳球虫基因组; 3, 5: 野生和缓艾美耳球虫基因组. B. Genome walking电泳图。AP1-4是4个随机引物; 1, 2, 3: 3轮PCR; M: DL 2000 plus marker。C. 外源基因HA1基因在球虫基因组中的插入位点。D. 和缓艾美耳球虫表达HA1的蛋白鉴定。1: 原核表达HA1蛋白Pet28aHA1阳性对照；2: Emi.HA1. E. IFA鉴定，原核表达HA1蛋白鼠源多抗作为一抗。a, b: 用穿膜剂处理; c, d: 不用穿膜剂处理。A. Detection of HA1 and YFP genes by PCR. 1：PCR products from plasmid pHEAAssHA1chFcA (positive control); 2, 4: DNA extracted from Emi.HA1; 3, 5: DNA extracted from wild type of E. mitis (negative control); M: DL plus 2000 molecular weight ladder. B. Gel electrophoresis of amplified products after the three nested genome walking PCRs. 1-3：Represents rounds of PCR; AP1-4: Random primers from genome walking kit; M: DL plus 2000 marker. C. Integrated sites of plasmid expression cassettes into E. mitis genome by genome walking. D. Detection of recombined HA1 protein by Western blot with mouse HA1 protein polyclonal antibody. 1: Purified HA1 protein expressed in E.coli (positive control); 2: Protein extracted from Emi.HA1; 3: Protein from wild type of E.mitis (negative control). E. IFA identification of sporozoites of Emi.HA1. a, b: Permeation treatment; c, d, Without permeation treatment.

2.4 转基因和缓艾美耳球虫的繁殖力

由图4可以看出，转基因和缓艾美耳球虫Emi.HA1与野生球虫的繁殖力具有较高的相似性，感染后第6 d达到排卵囊高峰，平均每只鸡可排2×107个卵囊。

图4 转基因和缓艾美耳球虫和野生球虫排卵囊曲线比较Fig. 4 Comparison of the oocyst shedding pattern of Emi.HA1 with that of the wild type strain感染后5～11 d间隔24 h进行卵囊计数。One group of four chickens were infected with 1 000 Emi.HA1, another group received 1 000 wild type parasites. Oocyst shedding was measured every 24 h between 5 d and 11 d post infection.

3 讨论

顶复门原虫的转基因操作为其生物学研究提供了强有力的工具。近几年来，转基因球虫的研究取得了很大进展，同时也促进了球虫免疫学领域的发展。柔嫩艾美耳球虫已经实现了稳定转染，促进了艾美耳球虫作为疫苗载体的研究进展。和缓艾美耳球虫亦寄生于消化道，但其致病力弱(Tyzzer,1929; Joyner 1958; Shirley, 1983; 朱珊珊等，2007)、免疫原性强(未发表数据)，是作为疫苗活载体的又一良好选择。本研究成功构建了稳定表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫，其繁殖力与野生球虫相当，提示获得的转基因和缓艾美耳球虫株具有作为疫苗活载体的潜能。

研究已表明药物和流式共筛选的筛选效率显著高于只用流式筛选的效率(Clarketal., 2008)。以乙胺嘧啶抗性基因和黄色荧光蛋白基因为筛选框的双框表达载体已利用核转染的方式转染弓形虫得到了验证，为其在转基因艾美耳球虫中的应用奠定了基础(汤新明等，2014)。在本研究中利用此双框表达载体双筛选的方法第3代发光率即可达到60%，与以往本研究室只用流式筛选的方法相比大大提高了转基因球虫的筛选速度。

本研究中的转基因和缓艾美耳球虫系Emi.HA1的排卵囊时间曲线与野生株一致；与之前报道的表达流感病毒M2e的转基因柔嫩艾美耳球虫株相似(Liuetal., 2013)；而与前人报道的柔嫩艾美耳球虫稳定转染群体TE1排卵囊时间相对延迟12 h (Yanetal., 2009)，本研究室另外一转基因和缓艾美耳球虫系的排卵囊时间与野生株相比相对延迟24 h(未发表数据)。这些研究结果之间的差异可能是由于转染的质粒随机插入球虫基因组所造成的，在本研究中我们检测到一个插入位点，其可能通过破坏宿主基因或外源基因的表达对转基因球虫的表型如繁殖力、排卵囊高峰造成影响 (Yanetal., 2009)。

研究表明，表达外源蛋白的转基因球虫免疫后可以激发宿主产生特异性的免疫应答。以表达黄色荧光蛋白(YFP)为模式抗原的柔嫩美耳球虫经口服免疫后可以激发鸡体产生较好的体液免疫应答和细胞免疫应答(Huangetal., 2011)；用表达弯曲杆菌CjaA蛋白的柔嫩艾美耳球虫口服免疫后可激发产生针对CjaA蛋白特异性的免疫应答，使肠道弯曲杆菌减少86%～91%(Clarketal., 2012)。转基因球虫表达外源蛋白的量对宿主激发产生特异性免疫应答至关重要，但是前人尚未对球虫表达外源蛋白的量进行研究。其中一个解决方法是用致病力较弱的球虫作为疫苗载体，可以通过增大免疫剂量来提高球虫在鸡体内表达外源蛋白的量，从而达到产生较强免疫应答的目的。目前堆型艾美耳球虫Eimeriaacervulina、巨型艾美耳球虫E.maxima和早熟艾美耳球虫E.praecox等球虫已经实现瞬时转染(Zouetal., 2009)，发展致病力较弱的球虫作为疫苗载体进而产生针对致病性病原特异性的免疫保护具有很大潜能(Liuetal., 2013)。其他增强球虫表达外源蛋白量的策略还需要进一步研究。本研究成功筛选出稳定表达H9N2禽流感病毒HA1的转基因和缓艾美耳球虫，为进一步研究此转基因和缓艾美耳球虫激发宿主产生针对H9N2禽流感病毒的免疫保护性奠定了坚实基础。