携抗HER-2抗体PLGA高分子纳米超声造影剂的制备及其体外寻靶实验

王翠薇 杜晶 杨仕平 胡鹤 李凤华

1.上海交通大学医学院附属仁济医院超声医学科，上海 200127；2.上海师范大学化学系，上海 200234

近年来高分子聚合物由于其生物兼容性、生物可降解性及良好的成膜性能被广泛应用于医用超声造影剂[1]，其中以聚乳酸（poly lactic acid，PLA）及聚乳酸-羟基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）应用最广泛。以聚合物为成膜材料制得的微泡包裹空气或全氟丙烷气体，产生较强的回声散射，是理想的超声造影剂材料。但肿瘤血管内皮间隙为400～600 nm，传统的聚合物微泡仅能局限于血池内显像，限制了其对血管外肿瘤细胞的检测能力[2-3]。本研究以PLGA为材料，樟脑为致孔剂，通过改进的双乳化溶剂挥发法制备纳米级PLGA超声造影剂，并将纳米粒子与荧光标记的抗HER-2抗体连接制备靶向纳米超声造影剂，检测其对乳腺癌SKBr3细胞的体外寻靶能力和体外显像效果。

1 资料和方法

1.1 材料和仪器

主要试剂：PLGA（50∶50，济南岱罡生物科技有限公司）；天然D（+）-樟脑、聚乙烯醇PVA1788低黏度型（醇解度87.0～89.0 mol/mol）及甘露醇（阿拉丁试剂上海有限公司）；二氯甲烷（上海润捷化学试剂有限公司）；全氟丙烷气体（上海人杰灵光学仪器有限公司）；异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；超纯水；异硫氰酸荧光素（ fluorescein isothiocyanate，FITC）-抗HER-2抗体（上海亿欣生物科技有限公司）；NHS/EDC（百灵威试剂，上海）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（赛默飞世尔科技）；多聚甲醛、DAPI（Sigma，美国）。

主要仪器：超声波细胞粉碎机；RE-2000旋转蒸发器；湘仪H-1650高速离心机；FD-1A-50冷冻干燥机；场发射扫描电子显微镜（S-4800，日本）；马尔文纳米粒度电位分析仪（ZEN3690，德国）；激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP5Ⅱ，德国）；离子溅射仪（JFC-1100，日本）。

细胞株：乳腺癌SKBr3细胞、MDA-MB-231细胞，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 纳米超声造影剂的制备

用改进的双乳化溶剂挥发法制备PLGA纳米粒子：①精确称取天然樟脑12.5 mg，溶于5 mL二氯甲烷；称取PLGA 125 mg，亦溶于二氯甲烷；磁力搅拌使充分溶解，得到无色透明溶液。②取PVA溶液（3%，W/V）1 mL，注入上述溶液，获得水-油两相液；在冰水浴条件下用声振仪进行第1次乳化（130 W，on 4 s/off 2 s，180 s），获得呈乳白色的一次乳化液。③将一次乳化液注入20 mL PVA溶液（3%，W/V）中，进行第2次乳化（130 W，on 4 s/off 2 s，180 s）。④将二次乳化液倒入100 mL异丙醇溶液（5%，V/V）中，旋转蒸发，使溶剂挥发、粒子表面固化。⑤将旋蒸后获得的混合液分装入15 mL离心管，12000 r/min离心10 min；弃上清液，取白色沉淀物复溶于超纯水中再次离心，重复3次；在沉淀物中加入微量甘露醇，分散于1 mL超纯水中，以铝箔包裹放入-20 ℃冰箱冷冻。⑥放入冷冻干燥机中24 h进行冷冻干燥，获得白色粉末，抽真空后注入全氟丙烷气体。⑦将产品密封避光保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3 PLGA纳米粒子的表征

用场发射扫描电子显微镜观察PLGA空心纳米粒子的形态：将PLGA空心纳米粒子分散在超纯水中，取适量分散均匀的样品涂布于铝箔粗糙面，制成干燥样品后用离子溅射仪进行喷金，在扫描电子显微镜下对粒子大小、形态、表面、分散性进行观察。

用纳米粒度电位分析仪将PLGA空心纳米粒子分散于超纯水，常温下测量PLGA空心纳米粒子的水合粒径及多分散指数。

用透射电子显微镜确认粒子是否具有空心结构：将PLGA粒子分散液滴到覆有碳膜的铜网上，用新鲜配制的磷钨酸溶液（1%，W/V）进行染色后在透射电子显微镜下进行观察。

1.4 靶向纳米超声造影剂的制备

室温下将PLGA 纳米粒子（1 mg/mL）分散液与耦联活化剂NHS/EDC孵育30 min， 16000 r/min离心10 min；弃上清液，复溶在PBS中，重复2次，去除未反应的耦联活化剂NHS/EDC。将活化后的PLGA纳米粒子分散在200μL PBS中，加入25μL 1μg/μL FITC-抗HER-2抗体，混合均匀后孵育30 min，以16000 r/min离心10 min；将沉淀物分散在PBS中，重复2次，去除游离抗体，获得靶向纳米超声造影剂，分散在50μL PBS中备用。

1.5 细胞培养和爬片的制作

在37℃、5% CO2、完全饱和湿度条件下培养两种乳腺癌细胞（SKBr3细胞、MDA-MB-231细胞），用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养SKBr3细胞，用含10%胎牛血清的L-15培养基培养MDA-MB-231细胞。两种细胞均以1×104/皿的密度培养于皿底厚度为0.17 mm的培养皿中，待细胞贴壁后24 h开始实验。

1.6 激光共聚焦显微镜观察靶向纳米超声造影剂体外寻靶及显像效果

取SKBr3细胞和MDA-MB-231细胞各一皿，分别加入25μL FITC-抗HER-2抗体；另取SKBr3细胞和MDA-MB-231细胞各一皿，分别加入25μL 靶向纳米超声造影剂。4皿细胞均孵育20～30 min，然后用PBS洗3遍，去除未结合的抗体及靶向纳米超声造影剂。用4%多聚甲醛溶液进行固定，用DAPI进行染核。以上操作均在避光条件下进行。

1.7 靶向纳米超声造影剂体外成像实验

靶向PLGA纳米粒子的体外成像效果：精确称取一定质量的PLGA空心纳米粒子粉末，制备成1 mg/mL的分散液，取5 mL注满橡胶塞封口的透明塑料样品管，同时取5 mL无气水注入同样的样品管中作为空白对照组。以无气水为透声窗，用百胜MyLab Twice超声诊断仪进行实时灰阶成像（中心频率22 MHz超高频探头，机械指数为0.06）。

2 结果

将制得的PLGA纳米粒子分散液样品烘干喷金后于扫描电子显微镜下观察，发现粒子呈球形，表面较光滑，形态规则，分散性好，粒子之间未见团聚（图1）。纳米粒度电位分析仪测得粒子平均粒径为（152.00±58.08）nm，多分散指数（polydisperse index，PDI）为0.221，表明粒子大小分布尚均匀（图2、3）。

图1 扫描电子显微镜下观察PLGA纳米超声造影剂粒子

图2 PLGA纳米超声造影剂粒子的平均粒径（size）和多分散指数（DLS）

图3 透射电子显微镜下观察经磷钨酸溶液染色后的PLGA纳米粒子的空心结构

如图4A所示，激光共聚焦显微镜下观察到FITC-抗HER-2抗体与SKBr3细胞连接的成功率较高，细胞核经DAPI染色激发显示为蓝色荧光，细胞膜上激发获得环状或点状绿色荧光，表明抗体成功结合到细胞膜上。图4B显示部分SKBr3细胞与靶向纳米超声造影剂结合，细胞膜显示点状的绿色荧光，表明靶向纳米超声造影剂可较多并牢固地连接到乳腺癌SKBr3细胞表面，未被PBS洗脱。图4C与图4D中，MDA-MB-231细胞膜表面未见抗体或靶向高分子造影剂黏附现象，进一步证实该靶向造影剂在体外对HER-2受体高表达的乳腺癌细胞具有较强的特异性亲和力。

图4 激光共聚焦显微镜观察

将浓度为1 mg/mL的纳米靶向造影剂注满体积为5 mL的样品管内，并以含5 mL脱气水的样品管为参考，用高频线阵探头观察靶向纳米高分子超声造影剂的体外显影能力。结果如图5所示，PLGA造影剂组显示为点状高回声，细腻均匀，对照组的水显示为无回声液性区。

图5 PLGA纳米靶向造影剂体外成像

3 讨论

用高分子聚合物PLGA为成膜材料制备获得的超声造影剂具有生物兼容性、生物可降解性，在生物体内可代谢为无毒的二氧化碳和水排出体外，对生物体无害，是理想的超声造影剂材料，具有良好的应用前景[4-5]。

本研究中，将樟脑溶解于主乳化剂中，通过改进的双乳化溶剂挥发法制备包裹樟脑的PLGA粒子，经冷冻干燥，樟脑升华，充入全氟丙烷气体获得PLGA纳米超声造影剂。该粒子表面较光滑，形态规则，平均粒径为（152.00±58.08）nm，粒径呈单峰分布，PDI为0.221，理论上可穿透肿瘤血管内皮间隙（400～600 nm）进入肿瘤组织，通过“被动靶向”作用使血管外靶组织显像成为可能，从而克服传统微泡造影剂仅能于血管内显像的局限性[6]。PLGA制备的纳米造影剂表面含有大量羧基，而单克隆抗体、配体、各种特异性短肽等活性物质多为蛋白，本身含有大量氨基，羧基与氨基可通过共价键耦联。本研究以EDC/NHS作为耦联活化剂，使活化PLGA上的羧基与单克隆抗体上的氨基结合，通过碳二亚胺法技术成功制得携抗HER-2 抗体的靶向PLGA纳米超声造影剂，并验证了其对HER-2受体高表达的乳腺癌SKBr3细胞的特异性结合能力。这种携抗HER-2 抗体的纳米超声造影剂有望在体内通过主动靶向作用，使超声造影剂以更高的浓度聚集在乳腺癌组织，达到定向增强显影的目的。

透射电子显微镜证实，本研究中制备的纳米粒子具有空腔结构，空腔结构的存在及全氟丙烷气体的导入可产生较强的回声散射。PLGA纳米超声造影剂与传统的微泡造影剂的大小差别较大，因此未采用超声诊断仪上适用于传统微泡造影剂的造影模式成像。初步体外超声成像实验证明，PLGA靶向纳米造影剂在高频超声条件下具有较好的显像效果。

PLGA纳米粒子表面的羧酸键（—COOH）及内部的空腔使其不仅可成为靶向超声造影剂，还可在粒子表面连接药物或在粒子内部定量封装药物，达到对肿瘤靶向诊断及治疗的目的[7]，为进一步开发具有诊断与治疗双重功能的PLGA纳米靶向载药造影剂打下良好的基础。

综上所述，本研究成功制备了携抗HER-2抗体的PLGA靶向纳米超声造影剂，能与HER-2受体高表达的乳腺癌细胞体外特异性靶向结合，且体外显像效果较好。

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