紫花苜蓿组织解剖结构对NaHCO3盐碱胁迫的响应

田晨霞,张咏梅,王凯，张万

(1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070；2.草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070；3.中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；4.甘肃农业大学研究测试中心，甘肃 兰州 730070)

全世界盐渍土面积约近10 亿hm2， 分布在世界各大洲干旱地区。我国盐碱化土地面积达9913 万hm2，主要分布在黄淮海平原、黄土高原及西北内陆区， 而东北平原和沿海地带也有大面积的盐碱地，其中东北、内蒙古和西北内陆盐碱化最为严重[1-3]。全国每年因盐碱化废弃的土地达25 万hm2， 盐化耕地每年少收粮食207亿kg， 年损失鲜草1218 亿kg[4-5]。盐碱对土壤危害是由盐碱土壤中HCO3-、CO32-、SO42-、Cl-四种阴离子和Na+、Ca2+、Mg2+三种阳离子组成的12 种盐所致[3]。大量盐分在土壤内积累会引起一系列土壤物理性状的恶化如土壤板结、通气性差、pH值上升、养分释放慢及渗透系数低等。更严重的是它能够扰乱渗透平衡、离子平衡、产生有毒代谢物[6]，从而导致植物根系吸水困难，生长发育缓慢，代谢受到抑制，严重时植物体内水分发生“反渗透”， 叶面出现盐斑，进一步萎蔫，甚至死亡[7-8]。盐碱胁迫是影响全世界作物产量的主要非生物胁迫之一，危害程度仅次于干旱，已成为制约农业发展的重要因素[9-10]。尽管盐胁迫下所有植物的生长都会受到抑制，但是不同植物对于致死盐浓度的耐受水平和生长降低率不同[11-12]。因此，探索盐碱胁迫对植物的影响，开展作物抗盐，耐盐性研究，提高作物的耐盐碱性，是农业进一步增产增收的重要基础，也是当前农业科学研究的热点，对开发和利用大面积的盐碱化土地具有重要意义[13]。

目前，苜蓿地面临不同程度的退化及盐碱化， 提高苜蓿耐盐性成为苜蓿植被恢复的关键问题之一。苜蓿富含蛋白质、多种维生素和矿物质，不但是多种家畜喜食的优质饲草饲料，而且其发达的根系能够防风固沙及保持水土[15-16]。王文斌等[17]指出苜蓿具有中强度抗盐特性，叶片具有排盐能力，是改良盐碱地的理想材料之一。盐渍化地区通过种植耐盐碱牧草，牧草的根系发挥其生理功能而对土壤理化性质发生改变，使盐碱土逐渐良性循环发展，减轻盐碱成分对植物的危害，既能达到治理盐碱土的目的，又能收获牧草[18-21]。近年来，国内外学者不但对耐盐碱牧草如星星草(Puccinelliatenuiflora)[22-25]和羊草(Leymuschinensis)[26-31]作了许多研究，对禾本科粮食作物如小麦(Triticumaestivum)[11,32]、燕麦(Avenasativa)[33-34]等和果蔬作物如豇豆(Vignaunguiculata)[35]、马铃薯(Solanumtuberosum)[36]等在盐碱胁迫或盐胁迫下的生理响应也做出大量研究。对于紫花苜蓿(Medicagosativa)关于盐碱胁迫的研究主要以盐碱处理下种子萌发[22]、幼苗生长[37]、抗性生理[16,19,38]以及分子生物学遗传基因[39-40]为主。研究表明土壤盐分不仅改变植物代谢机制，而且影响植物的正常生长，尤其是植物的形态学和解剖学[41]。 有研究[42]推断在高盐环境中生长良好的植物可能拥有特殊的结构适应性以改变其生理和生化机制，得以维持其繁殖能力。

目前，人们关于中性盐(NaCl)对植物危害的研究较多[43-49]，相关文献也较丰富。但是，从盐胁迫生理角度考虑，碱性盐除了具有中性盐的胁迫因素，如离子毒害、离子不平衡、低渗透势和各因子的综合作用外，还具有高pH及明显降低矿质元素可利用性等特殊因素。碱性盐因其比中性盐具更复杂的危害、更严重的生态破坏力，因此以碱性盐作为逆境的研究也就更具有代表性。本研究以甘农3号紫花苜蓿作为试验材料，不同浓度NaHCO3对苜蓿幼苗进行盐碱胁迫，采用石蜡切片技术，观察分析各供试材料在不同胁迫浓度下的苜蓿根、茎、叶显微结构特征，摸清和了解苜蓿在盐胁迫下的显微结构特点，并掌握其结构与功能相适应的关系。本研究旨在为盐渍化草场畜牧业的发展、盐碱土的改良和利用、苜蓿的耐盐机制的深层研究提供一定的理论基础[50]，并为植物抗逆研究提供一些基础数据。同时，欲寻找耐盐牧草的特有解剖结构，为苜蓿田间育种判定耐盐植株提供一个直观的、可靠的判断指标。

1 材料与方法

1.1 材料

甘农3号紫花苜蓿种子由甘肃农业大学曹致中教授馈赠。

材料于2012年3月5日播种。将盛有蛭石和珍珠岩(8∶1)的15个花盆，浇透水，再选取籽粒饱满的种子分别播种，并覆以无纺布保湿。待幼苗长至3 cm高时，进行疏苗，每盆保留20株健壮幼苗。每天浇20 mL Hoagland’s营养液，促进幼苗健康生长。生长60 d后进行盐碱胁迫处理。先以50 mmol/L NaHCO3处理液代替日常灌水，使幼苗适应。再逐渐提高浓度，使NaHCO3处理液终浓度分别为100和150 mmol/L，以蒸馏水处理作为对照。每个处理各5盆，重复3次。10 d后，分别剪取各处理植株根、茎、叶材料，根部为根茎下1～2 cm处；叶片取第3叶位之三出复叶中间的小叶；茎部材料取第3叶位的茎段。所取材料快速浸入FAA溶液(70%或50%酒精∶冰醋酸∶福尔马林=90∶5∶5)中进行固定。

1.2 方法

采用常规石蜡切片技术。将FAA固定的材料，经酒精系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，LEICA全自动切片机切片。根、茎为10 μm厚切片，叶片为8 μm厚切片，充分烤片后，进行番红-固绿双染色。BX61型正置万能显微摄像生物显微镜下观察并拍照。所拍照片采用MRAS系列RPP 4.5型图像分析系统进行测量。

LEICA 全自动切片机(德国)、BX61型正置万能显微摄像生物显微镜(日本奥林巴斯光学工业株式会社)、MRAS系列RPP 4.5型图像分析系统(日本奥林巴斯光学工业株式会社)。

1.3 数据统计与分析

测量数据采用SPSS Statistics 17.0软件，单因素ANOVA分析处理，Duncan’s新复极差法进行显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 NaHCO3胁迫对叶片结构的影响

甘农3号紫花苜蓿叶片为典型的异面叶，由上表皮细胞、栅栏组织、海绵组织和下表皮细胞组成。上下表皮由长圆形排列紧密的单层细胞组成，且表皮细胞的外壁有较厚的角质层；栅栏组织是紧靠上表皮下方，长圆柱状，紧密排列呈栅栏状并垂直于表皮细胞的组织，该组织细胞内含较多的叶绿体；海绵组织由靠近下表皮的排列疏松不规则的短小细胞组成，细胞间有较大间隙；叶脉是叶肉中的维管束，木质部有孔径较大细胞壁加厚的木质导管，具有运输和支持作用。

随着NaHCO3浓度的增大，苜蓿叶片的内部结构发生了相应的变化，并且呈现一定的规律性，叶结构的主要变化情况从总体上可归纳为： 1)随着NaHCO3浓度的增加叶片厚度与对照相比分别显著变小了25.79%和37.32%，且叶片内的各组成部分均显著变薄； 2)叶片上、下表皮细胞排列越来越不规整，上表皮细胞平均厚度与对照相比分别减少了43.75%，41.52%，下表皮细胞平均厚度与对照相比分别减少了72.47%，89.31%，但表皮细胞壁角质层越来越厚； 3)随着NaHCO3浓度的增加，栅栏组织和海绵组织厚度均变小，NaHCO3对海绵组织的影响比栅栏组织更严重，海绵组织厚度的降幅分别为48.15%，32.93%，栅栏组织的降幅分别为27.26%，26.83%，值得注意的是栅栏组织与海绵组织的比值分别为0.77，0.90，0.94，这表明在整体叶片变薄的情况下，海绵组织的比例减小，栅栏组织的比例加大； 4)栅栏组织细胞长度减小，组织层变薄，排列逐渐疏松，细胞间隙越来越大； 5)海绵组织细胞愈小，由紧密变疏松，出现了发达的气腔，间隙逐渐发达； 6)NaHCO3对主叶脉的影响更严重，维管束中的木质导管数量急剧减少，孔径变小，木质部、韧皮部之间几乎无形成层(表1，图1)。

2.2 NaHCO3胁迫对茎结构的影响

苜蓿的茎由外到内分别由表皮、皮层、维管束和髓组成。表皮细胞由一层排列整齐的矩形细胞组成，细胞外壁角质层加厚。皮层由5～6层大小不等的厚壁细胞和薄壁细胞相间组成。苜蓿的茎内的维管组织成束状不连续排列包围髓腔。茎内髓细胞由大小不等的圆形薄壁细胞组成。每个维管束靠近髓腔部位是由细胞壁加厚的圆形木质导管组成，靠近皮层的一侧为韧皮部，木质部和韧皮部之间的部分为形成层。

随着NaHCO3浓度由低到高的变化，植物茎的内部结构也发生了相应的变化，并且呈现一定的规律性，茎结构的主要变化情况从总体上可归纳为：1) 茎的表皮细胞随着浓度增大逐渐由圆形大小不均一的细胞变为方形大小均一的细胞，表皮厚度几乎无变化；2)茎的皮层细胞逐渐排列紧密且与对照相比皮层细胞层分别加厚13.92%，26.93%；3) 维管束木质导管数量减少，导管孔径与对照相比分别变大14.72%，39.67%，且木质导管壁显著加厚；4)髓腔面积显著减小，其直径与对照相比分别减少30.99%，46.40%，髓细胞间的间隙逐渐缩小，髓细胞由不规则逐渐变得有规则且髓细胞壁显著加厚(表2，图2)。

2.3 NaHCO3胁迫对根结构的影响

幼嫩的根由表皮、皮层、维管组织组成，试验材料生长时长为70 d，苜蓿根横切面从外到内分别为周皮、次生韧皮部、形成层、次生木质部、原生木质部。周皮是有加粗生长的根的表面的次生保护组织。在根加粗生长时，次生分生组织木栓形成层的细胞进行平周分裂，形成径向排列的细胞层，这些细胞向外分化成木栓层，向内分化成栓内层。木栓层、木栓形成层和栓内层三者合称周皮，代替破坏、脱落的表皮行使保护功能。木栓具多层细胞，在横切面中细胞呈长方形，紧密排列成整齐的径向行列，细胞壁较厚，并且强烈栓化，细胞成熟时原生质体死亡解体，细胞腔内通常充满空气。木栓形成层的结构比维管形成层简单，形状也较规则，从其横切面上看为扁长方形，从纵切面上看为长方形或多边形。栓内层是薄壁的生活细胞，常常只有一层细胞厚，一般只能从它们与外面的木栓细胞排成同一整齐的径向行列，而与皮层薄壁细胞存在差异。周皮内的次生韧皮部是指形成层细胞分裂形成于其外侧的韧皮部。形成层是根中位于木质部和韧皮部之间的一种分生组织。经形成层细胞的分裂，可以不断产生新的木质部与韧皮部，使根不断加粗。形成层中纺锤形原始细胞形成的纵向组织(导管、管胞、木纤维、木薄壁组织)和由射线组织原始细胞产生的次生射线组织形成次生木质部，其最内层为原生木质部。

图1 NaHCO3胁迫下甘农3号叶片解剖学变化Fig.1 Anatomical changes of leaflets from Gannong No.3 exposure to NaHCO3 stresses A1-A3为对照 0 mmol/L NaHCO3处理 0 mmol/L NaHCO3 treatment；B1-B3为100 mmol/L NaHCO3处理100 mmol/L NaHCO3 treatment；C1-C3 为150 mmol/L NaHCO3处理150 mmol/L NaHCO3 treatment；(×400). 1, 叶尖Leaf apex；2, 叶片中部Middle part of leaf；3, 叶脉Leaf vein； co，皮层Cortex；pt，栅栏组织Palisade tissue；st，海绵组织Spongy tissue； ue，上表皮Up-epidermis； de， 下表皮Down-epidermis； vb， 维管束Vascular bundle；xy，木质部Xylem； ph，韧皮部Phloem.

处理Treatments(mmol/L)表皮Epidermis(μm)皮层Cortex(μm)维管束Vascular bundle维管束面积Area (μm2)维管束直径Length (μm)木质导管直径Xylem vessel (μm)髓腔Pith(μm)髓薄壁细胞Pith parenchymatous(μm)028.37±7.91 a56.04±13.94 a16529.05±5198.44 a446.59±73.37 a9.78±1.76 a707.50±81.56 a73.32±11.00 a10026.64±2.65 a63.84±14.45 ab11451.16±3698.65 b337.32±64.78 b11.22±3.67 b540.11±58.30 b71.53±16.20 a15025.88±4.65 a71.13±2.47 b8958.51±3352.90 c327.78±61.67 c13.66±3.58 c483.25±54.60 c57.11±9.11 b

图2 NaHCO3胁迫下甘农3号茎解剖学变化Fig.2 Anatomical changes of stems from Gannong No.3 exposure to NaHCO3 stresses D4-D6为对照0 mmol/L NaHCO3处理0 mmol/L NaHCO3 treatment；E4-E6为100 mmol/L NaHCO3处理100 mmol/L NaHCO3 treatment；F4-F6为150 mmol/L NaHCO3处理150 mmol/L NaHCO3 treatment；4, 茎的横切面Cross section of stem；5, 维管束部位Cross section of vascular；6, 髓腔Cross section of medullare；(D4，E4，F4， ×100，其他为The others×400). co，皮层Cortex； ca，形成层Cambial； ep， 表皮Epidermis； vb， 维管束Vascular bundle； xy，木质部Xylem； ph，韧皮部Phloem；pi，髓Pith.

随着NaHCO3浓度由低到高的变化，植物根的内部结构也发生了相应的变化，并且呈现一定的规律性，根结构的主要变化情况从总体上可归纳为： 1) 随着盐浓度加大，根部显著加粗，根部直径分别加粗12.82%和42.14%； 2)根内木质导管直径显著变小但数量显著增多，木质导管直径分别减小46.62%和12.22%，但是整个木质部直径显著增加，分别为19.30%和64.07%； 3)NaHCO3对韧皮部的影响虽不及对木质部，但韧皮部也显著加厚，分别为16.84%和30.81%； 4)周皮厚度几乎无变化，但细胞随盐碱浓度增大而排列更紧密。5)随着盐碱浓度增大，根部凯氏带逐渐明显(表3，图3)。

2.4 NaHCO3胁迫对根冠比的影响

NaHCO3盐碱胁迫严重抑制了甘农3号紫花苜蓿幼苗的生长，使甘农3号紫花苜蓿地上部分和地下部分的生物量均降低，但对地上生物量影响更甚，造成根冠比的升高。其中0,100和150 mmol/L NaHCO3处理下甘农3号紫花苜蓿的根冠比分别为79.22%，116.63%和148.82%，100和150 mmol/L NaHCO3处理与对照相比根冠比增加了46.83%和87.86%，均达显著水平(表4)。

表3 NaHCO3盐碱胁迫对甘农3号紫花苜蓿根结构的影响Table 3 Effect of saline and alkaline stress on roots structure of Gannong No.3 μm

图3 NaHCO3胁迫下甘农3号根解剖学变化Fig.3 Anatomical changes of roots from Gannong No.3 exposure to NaHCO3 stresses G7-G9为对照0 mmol/L NaHCO3处理0 mmol/L NaHCO3 treatment；H7-H9为100 mmol/L NaHCO3处理100 mmol/L NaHCO3 treatment；I7-I9 为150 mmol/L NaHCO3处理150 mmol/L NaHCO3 treatment；7, 根的横切面Cross section of root；8, 根的木质部Xylem of root；9, 根的周皮及皮层下组织Periderm and subcortex of root; (G7,H7,I7, ×100，其他为The others×400). pr，周皮Periderm；sp， 次生韧皮部Secondary phloem； sx， 次生木质部Secondary xylem； ca，形成层Cambial；px， 原生木质部Protoxylem.

3 讨论

盐碱环境中生长的植物不仅面临着盐分过高产生的盐害问题；还要面临碱性土壤pH升高，土壤理化性质不良；土壤条件的恶化最终导致植物的水分和营养缺乏，使植物面临生理饥饿的威胁。盐碱化程度高的土地会造成土壤溶液渗透压提高，作物膨压的丧失，细胞壁大量积累盐，引起生长受抑[51]。盐碱土通常能够抑制植物的发育，对植物的生长产生负作用影响[18]，但是植物在轻度盐碱胁迫下耐盐植物能以不同的结构去适应不同的生态环境。

表4 NaHCO3胁迫对根冠比的影响Table 4 The effect of NaHCO3 stress on ratio of roots to aboveground parts in Gannong No.3

3.1 盐碱胁迫对叶片解剖结构的影响

叶是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官，在植物进化过程中与周围环境关系密切[52]，其结构特征最能体现植物对环境的适应[53]。在植物的结构与环境关系方面，历来研究最多的器官是叶[54-56]，对盐生植物的研究也是如此[57-60]。通过观察盐胁迫下甘农3号紫花苜蓿叶片显微结构的形态变化，随着NaHCO3浓度的增加叶片内的各组成部分均显著变薄，这与碱茅(Puccinelliadistans)在盐生环境中叶片的变化不同。叶片上、下表皮细胞排列越来越不规整，表皮细胞壁角质层越来越厚，这与朱宇旌等[61]在小花碱茅(Puccinelliatenuiflora)中对叶片的显微结构研究相同。随着NaHCO3浓度的增加，栅栏组织和海绵组织厚度均变小，NaHCO3对海绵组织的影响比栅栏组织更严重，海绵组织厚度的降幅分别为48.15%，32.93%，栅栏组织的降幅分别为27.26%，26.83%，值得注意的是栅栏组织与海绵组织的比值分别为0.77，0.90，0.94，这表明在整体叶片变薄的情况下，相对来说海绵组织变薄，栅栏组织加厚。海绵组织薄壁细胞有明显的体积增大现象。薄壁组织细胞体积增大后能容纳更多的水分，可以稀释细胞内的盐浓度[62]。NaHCO3对主叶脉的影响更严重，维管束中的木质导管数量急剧减少，孔径变小，这样的结构使得从茎输送至叶片的水分变少，是苜蓿减少水分输送的方式。

3.2 盐碱胁迫对茎解剖结构的影响

茎下接根上接叶片，通过木质部将根部吸收到的水分和矿物质往上运输到各营养器官，通过韧皮部将叶片通过光合作用的产物往下运输，并将叶产生的有机物质运送到根内或暂存茎内[63]。本文对苜蓿的茎在不同浓度盐碱胁迫下的显微结构进行了观察研究，研究其在盐碱胁迫下苜蓿所发生的适应性变化，以进一步探明苜蓿的耐盐碱机理。茎中皮层较厚，维管束与髓部薄壁细胞都发达。在盐碱胁迫下，茎通过对皮层、维管组织髓的结构改变来适应环境的变化。茎的表皮细胞随着浓度增大逐渐由圆形大小不均一的细胞变为方形大小均一的细胞，表皮厚度几乎无变化；茎的皮层细胞逐渐排列紧密且与对照相比皮层细胞层分别加厚13.92%,26.93%。苜蓿的维管束贴近茎边缘围绕着髓腔排列成一圈，维管束木质导管数量减少孔径与对照相比分别变大14.72%,39.67%，木质导管壁显著加厚。髓腔面积显著减小，其直径与对照相比分别减少30.99%，46.40%，髓细胞间的间隙逐渐缩小，髓细胞由不规则逐渐变得有规则且髓细胞壁显著加厚。这有利于阻止体内水分的散失，而机械组织厚度的显著增加则对植株失水条件下抗倒伏有利[63]。

3.3 盐碱胁迫对根解剖结构的影响

根是植物的营养器官，通常位于地表下面，负责吸收土壤里面的水分及溶解其中的离子，并且具有支持，贮存合成有机物质的作用。盐碱胁迫中的植物，由于根系始终处于盐碱土壤中根系首先感知土壤盐碱含量的变化，然后将其传递于叶片[28,64]。苜蓿的根受盐碱胁迫的影响也非常大，随着盐浓度加大，根部显著加粗，根部直径分别加粗了12.82%和42.14%，从而增强根的吸收作用；根内木质导管直径显著变小但数量显著增多，木质导管直径分别减小了46.62%和12.22%；根部整个木质部的直径显著增加，与对照相比分别增加了19.30%和64.07%，这就更进一步加强了对根部离子运输的控制与选择；NaHCO3对韧皮部的影响虽不及对木质部，但韧皮部也显著加厚，分别为16.84%和30.81%。在苜蓿生长到一定阶段根部会形成周皮，周皮细胞随盐碱浓度增大而排列更紧密。万长贵和邹秀莹[21]指出根系有阻止盐分进入输导组织的功能，周皮的形成进一步加强阻止盐、碱离子进入根部导管。在盐碱胁迫下，根部所有组织内细胞壁均明显加厚，木质导管壁加厚程度更为显著，这种特殊结构在高盐碱胁迫下大大抑制了有毒有害离子的进入。且随着浓度由低到高的变化，植物的木质部导管明显增多，木质部是植物运输水分的主要组织，盐碱处理使得缺水，植物需要深入地下很深吸收水分，木质部导管孔径的增大无疑会利于植物体内水分的运输，为植物的生理代谢提供有利条件。

4 结论

植物所在环境决定了植物的形态结构，反过来，植物能以不同的形态结构去适应不同的生态环境，这通常被认为是植物对特殊生境的演化适应。本研究对豆科植物紫花苜蓿的结论再次印证了盐碱胁迫可以诱导植物细胞和组织发生结构性的改变，使植物的根、茎、叶在解剖学或细胞学水平上产生不同程度的变化以适应生长环境的盐渍化。通过对甘农3号紫花苜蓿在NaHCO3胁迫下的根、茎和叶显微结构变化，表明甘农3号紫花苜蓿对盐渍环境的适应能力不是单靠某一器官某一种结构而实现的。为适应盐碱胁迫的环境，甘农3号紫花苜蓿演化出各自不同的拮抗盐碱逆境的结构，从而达到改善并利用盐碱地，防治土地近一步退化的作用。