放线菌D01对马铃薯4种病原真菌的抑菌作用

陈淑琴，王生荣

(甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070)

甘肃省是全国马铃薯(Solanumtuberosum)主产区之一，省内大部分地区适宜马铃薯种植，主要分布在甘肃中东部地区的大部分山地和张掖、武威等地海拔1700 m左右的沙性土壤地区[1-2]，随着种植面积的不断扩大，马铃薯产业已经发展成为甘肃省贫困地区群众脱贫致富的一个主导产业。而近年来马铃薯真菌病害的普遍发生，已成为影响马铃薯产量与质量的严重障碍。目前马铃薯生产中主要依靠化学农药来防治，但化学农药的长期频繁使用已导致病菌抗药性逐渐增强、环境污染日益严重[3]。而拮抗性微生物是生物农药的重要来源，其中放线菌是具有巨大应用价值的微生物类群，已有研究表明放线菌能产生许多重要生理活性物质，如抗生素类物质、植物生长促进物质、植物生长抑制物质以及具有新特性的酶类，在农业生产和医药新药的筛选上显示出广阔的应用前景[4-9]。放线菌作为农用抗生素的主要产生菌在植物病害的生物防治中占有重要的地位，是新医药、新农药和生物防治活菌制剂的源头[10-13]，在目前10000多种微生物的生物制剂中，有50%以上是放线菌产生的[14-16]，应用放线菌的生物资源有着巨大的社会效益和生态效益。

近年来，利用拮抗微生物尤其是真菌、细菌及其代谢产物控制植物病害已有一些报道[10]，但利用放线菌及其代谢产物抑制的报道还不多见。本文采用平板对峙法等对分离自马铃薯田的放线菌菌株D01对马铃薯4种病原真菌皿内抑菌效果进行了测定，目的是为马铃薯真菌性病害生物防治提供新的途径和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试靶标病原菌,马铃薯干腐病菌(Fusariumspp.)、马铃薯黑痣病菌(Rhizoctoniasolani)、马铃薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、马铃薯早疫病菌(Alternariasolani)，均由甘肃农业大学植物病理学实验室2012年4月到2012年8月分离得到。

放线菌D01的来源,分离自甘肃省主要马铃薯种植区土壤样品(2012年6月采自甘肃省定西市陇西县巩昌)，经过初步生理生化测定并测序鉴定(另文发表)，编号为D01。

培养基,①PDA培养基，②高氏一号培养基，③液体发酵培养基：1%小米浸出汁1000 mL、葡萄糖10.0 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 2.5 g、CaCO32.0 g、pH值7.2～7.4。

1.2 方法

1)供试病原菌及放线菌的活化培养

4种病原真菌进行活化培养，无菌条件下，将病原菌菌种接种在PDA平板培养基上，25℃恒温培养3～4 d，备用。将保存的放线菌D01在高氏一号培养基上进行划线培养，28℃恒温培养4 d，备用。

2)抑菌活性测定

①平板对峙法：在无菌操作条件下，倒PDA平板，冷却，用直径 6 mm的打孔器分别打病原菌和放线菌菌饼。将病原菌接种在PDA平板中间，28℃培养1 d后，然后在距离病原菌十字对称25 mm处接种放线菌菌饼[17]，每处理3次重复，28℃恒温培养4 d，观察记录对照菌落直径与处理后靶标真菌菌落直径，两者之差为抑菌带宽度。②放线菌的发酵培养：放线菌菌株D01在高氏一号平板培养基28℃培养4 d，按5%的量接种于250 mL三角瓶内的50 mL的液体发酵培养基内，28℃，180 r/min恒温振荡培养7 d[18]。发酵液在4℃、10000 r/min离心20 min，上清液4℃储存备用。③抑制菌丝生长速率法：PDA培养基分装灭菌，待冷却到55℃时，将放线菌菌株发酵液与PDA培养基按1∶9的比例混匀，倒入无菌培养皿中制成含发酵液培养基。培养基凝固后，在每个培养基平面接入靶标菌菌饼，将菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，每处理3次重复。培养3～4 d后，用十字交叉法测定菌落直径，计算抑菌率[19]。

抑菌率(%)=(1-处理供试菌菌落直径/对照供试菌菌落直径)×100%

3)受抑菌丝显微观察

在被抑制的菌落边缘，挑取少量靶标真菌基内菌丝，镜检观察菌丝受抑制情况，并进行显微照相。

4)受抑菌丝再生能力测定

从被抑制的菌落边缘，挑取少量靶标真菌基内菌丝接种于PDA平板上，以正常基内菌丝为对照，28℃下培养，每24 h观察菌落生长情况，测量并记录菌落直径，确定受抑制靶标真菌菌丝的再生能力[15-16]，每处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 放线菌D01对4种马铃薯病原真菌的抑制效果

采用平板对峙法、发酵液抑制菌丝生长速率法测定了放线菌D01对4种靶标真菌的抑菌作用，平板对峙培养结果(表1)表明，放线菌D01对4种靶标真菌均具有显著的抑制作用，抑菌带宽度均大于15 mm。生长速率法培养结果(表1)也表明，放线菌D01对马铃薯黑痣病菌、马铃薯早疫病菌表现出显著的抑制作用，抑制率均大于80%，对马铃薯干腐病菌、马铃薯炭疽病菌也有较显著的抑制效果，抑制率均在70%～75%之间。总体可以看出，放线菌对马铃薯的4种病菌表现出了稳定的抑菌作用。

表1 放线菌D01对4种靶标真菌的皿内抑制作用

2.2 受抑菌丝的形态变化

显微观察发现，受抑制靶标真菌的菌丝形态均发生了显著的变化，但变化的细微处不同，放线菌作用于马铃薯黑痣病菌和马铃薯早疫病菌后，观察到其基内菌丝表现畸形，菌丝变粗，顶端变圆，隔膜增多等畸变现象(图1)。而马铃薯干腐病菌和马铃薯炭疽病菌在受到放线菌抑制后，镜检可以发现其基内菌丝的细胞壁被消解，原生质浓缩，菌丝尖端膨大等(图2)。由此可以看出，经放线菌处理以后，靶标真菌的基内菌丝发生了不同程度的畸变，而且会随着处理时间的延长而程度加深。

2.3 受抑制菌丝的再生能力测定

测定靶标真菌受抑制的菌丝能否恢复生长能力，也就是放线菌对靶标真菌是否具有持续抑菌作用，结果表明，被抑制的马铃薯干腐病菌和马铃薯早疫病菌菌丝在正常条件下仍然可以恢复生长，但生长速率缓慢，菌落比对照稀疏，日生长量远低于对照(图3，图4)；马铃薯炭疽病菌受D01抑制后，被抑制的菌丝在48 h后才缓慢恢复生长，但生长量小，且菌落颜色加深(图5)；马铃薯黑痣病菌受D01抑制后，受抑制的菌丝在正常条件下生长明显缓慢，24 h内生长量为零，此后逐渐缓慢恢复生长(图6)。放线菌D01对马铃薯的4种病原真菌不同程度的表现了持续抑菌作用。

图1 放线菌D01对马铃薯黑痣病菌的作用Fig.1 Inhibiting effects on R. solaniA.CK菌丝体Normal mycelium; B.抑制后的菌丝体Inhibiting mycelium; C.CK; D.皿内拮抗作用Antifungal activity in petri dishes.

图2 放线菌D01对马铃薯干腐病菌的作用Fig.2 Inhibiting effects on Fusarium spp.A.CK菌丝体Normal mycelium; B.抑制后的菌丝体Inhibiting mycelium; C.CK; D.皿内拮抗作用Antifungal activity in petri dishes.

图3 干腐病菌受抑制后菌丝再生能力的变化Fig.3 Growth of mycelium of Fusarium spp.

图4 早疫病菌受抑制后菌丝再生能力的变化Fig.4 Growth of mycelium of A. solani

图5 炭疽病菌受抑制后菌丝再生能力的变化Fig.5 Growth of mycelium of C. coccodes

图6 黑痣病菌受抑制后菌丝再生能力的变化Fig.6 Growth of mycelium of R. solani

3 结论与讨论

1)平板对峙法和生长速率法的结果表明，放线菌D01对4种马铃薯病原菌均有较强的抑制作用，其中放线菌D01对马铃薯黑痣病菌和马铃薯早疫病菌表现出了显著的抑菌效果，抑菌带较宽，均大于20.0 mm，发酵液提取物的抑菌率也都大于80%；而对马铃薯炭疽病菌和马铃薯干腐病菌也有较显著的抑制作用，拮抗带宽度也都在15.0～20.0 mm，发酵液提取物的抑菌率也都在70%～75%。

2)受抑制菌丝的显微观察和再生能力的测定结果表明，放线菌D01对4种马铃薯病原真菌均表现出较显著的持续作用，对受抑制菌丝观察也发现，放线菌可能产生或者分泌了某种物质，使得靶标真菌的菌丝发生畸变，从而达到对靶标真菌的持续抑制效果。放线菌可能合成了多种抗生素，干扰了病原菌的代谢作用，影响病原菌的形态结构；或者分泌了某种细胞壁降解酶类或有毒的次生代谢产物，导致细胞破裂，菌丝尖端几丁质呈裸露状态，生长受阻，从而抑制病原菌的发生发展。

目前，对放线菌作用于植物病害防治的研究已经取得了很大进展，但应用的过程中还存在一些问题。诸如有很多放线菌在实验室中生防效果良好，但在大田试验中不尽人意；放线菌活菌制剂在田间的不稳定性；部分放线菌抗菌谱较窄，应用价值也比较低等等。分子生物学、遗传学等多种手段的应用，将会进一步明确放线菌的生防机制，进行菌种改良与高效筛选，使其更好地投入到农业生产实践中。